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Microscopia - Brilho e Imagem: Independentemente do modo de imagem utilizado na microscopia óptica, o brilho da imagem é governado pelo poder de captação de luz da objetiva, que é uma função da abertura numérica. Assim como o brilho da iluminação da fonte do microscópio é determinado pelo quadrado da abertura numérica de trabalho do condensador, o brilho da imagem do espécime é proporcional ao quadrado da abertura numérica objetiva.
Ao contrário da situação para o sistema de iluminação do microscópio, no entanto, a ampliação objetiva também desempenha um papel importante na determinação do brilho da imagem. Na verdade, o brilho da imagem é inversamente proporcional ao quadrado da ampliação lateral:
∝ de brilho da imagem (NA/M)2
onde NA é a abertura numérica objetiva e M é a ampliação. A razão dada na equação acima expressa o poder de captação de luz do objetivo na transiluminação (nota: o caso da epi-iluminação é um pouco diferente, como discutido abaixo). Exemplos do poder de captação de luz de objetivos selecionados com diferentes graus de correção óptica estão listados na Tabela 1. Em geral, objetivas com aberturas numéricas altas também são mais bem corrigidas para aberrações. Assim, para a mesma ampliação, objetivas de maior abertura numérica coletam mais luz, produzem uma imagem mais brilhante e melhor corrigida (ver Tabela 1), e a imagem geral é melhor resolvida.
Pelo exame dos dados da Tabela 1, fica evidente que, nos casos em que uma objetiva é usada para transiluminação, o brilho da imagem diminui rapidamente à medida que a ampliação aumenta em uma série de objetivas com correção idêntica. Em contraste, a utilização de uma série semelhante de objetivas para epi-iluminação produz imagens cada vez mais brilhantes à medida que a ampliação aumenta através das faixas mais baixas (10x a 40x), mas tende a diminuir em ampliações mais altas. Também é aparente uma tendência para que os objetivos produzam imagens muito mais brilhantes em epi-iluminação (em oposição à transiluminação) nos mais altos valores de abertura numérica.
Os termos F(trans) e F(epi) utilizados na Tabela 1 referem-se ao poder de captação de luz de um objetivo e foram calculados de acordo com as seguintes equações:
F(trans) = 104 • NA 2/M2
F(epi) = 104 • (NA 2/M)2
Em teoria, a intensidade da iluminação depende do quadrado da abertura numérica do condensador e do quadrado da desampliação da imagem da fonte de luz (com efeito, a imagem do diafragma de campo torna-se mais brilhante à medida que se torna menor, de acordo com a lei do quadrado). O resultado é que o brilho da imagem do espécime é diretamente proporcional ao quadrado da abertura numérica objetiva ao atingir a ocular (ou sistema de câmera), e também inversamente proporcional à ampliação objetiva. Portanto, ao examinar corpos de prova em luz transmitida, a alteração da objetiva sem alterar o condensador afeta o brilho da imagem em resposta a mudanças na abertura numérica e ampliação.
Poder de Captação de Luz de Objetivos Selecionados
No caso da epi-iluminação, as mesmas considerações se aplicam, exceto que o objetivo também atua como condensador, e isso deve ser levado em conta ao considerar o brilho da imagem. À medida que a ampliação objetiva aumenta, a imagem da fonte de luz é reduzida (desampliada) em uma quantidade equivalente, resultando em um nível de brilho menos dependente da ampliação objetiva e mais dependente da abertura numérica (o brilho é governado pela quarta potência de abertura numérica na epi-iluminação). Na prática, os números de brilho da imagem variam (ver Tabela 1) devido a diferenças objetivas de tamanho de abertura traseira.
Quando o nível de luz é limitador, a objetiva de maior abertura numérica deve ser empregada, mas as ampliações da objetiva e da ocular devem ser mantidas no nível mais baixo compatível com a resolução desejada. Em muitos casos, os fabricantes agora estão fornecendo objetivas de imersão em óleo com aberturas numéricas mais altas e, correspondentemente, valores de brilho de imagem mais altos, do que contrapartes de alta seca de ampliação semelhante. Por exemplo, a objetiva de imersão apocromática plana de 40x na Tabela 1 tem o dobro da abertura numérica da objetiva plana acromática 40x seca, e produz quatro vezes o brilho da imagem na luz transmitida. Essas objetivas produzem uma diferença de 16 vezes no brilho da imagem sob iluminação de epifluorescência, com a versão de imersão em óleo de alta abertura numérica produzindo as imagens mais brilhantes. A Figura 2 apresenta uma comparação das diferenças relativas nos tamanhos dos cones de luz entre as objetivas de abertura numérica baixa e alta. Note que a objetiva de abertura numérica mais alta tem um cone de luz muito maior, elementos de lente interna maiores e é capaz de coletar muito mais luz do espécime do que a objetiva com uma abertura numérica menor.
A quantidade de luz transmitida através dos componentes ópticos do microscópio, em função da intensidade incidente, é especialmente crítica na microscopia de fluorescência. Em situações em que imagens de fluorescência de alta resolução requerem altas ampliações com uma perda mínima de brilho da imagem, as objetivas de abertura numérica mais altas com o maior grau de transmissão de luz devem ser empregadas. Como discutido acima, o brilho geral da imagem diminui rapidamente à medida que a ampliação aumenta, portanto, os componentes de um microscópio de fluorescência devem ser cuidadosamente escolhidos para maximizar a quantidade de luz que passa pelo trem óptico.
Brilho da Imagem - Java Tutorial
Na microscopia óptica, o brilho da imagem é governado pelo poder de captação de luz da objetiva, que é uma função da abertura numérica. A ampliação também desempenha um papel na determinação do brilho, conforme explorado neste tutorial interativo.
O tutorial é inicializado com a ampliação objetiva definida para 10x e um valor de abertura numérica de 0,15, que é ajustável usando o controle deslizante de abertura numérica. À medida que o controle deslizante é traduzido para aberturas numéricas mais altas em uma ampliação fixa, o tamanho do cone de luz muda e os valores de brilho (intensidade) da imagem para os modos de iluminação de luz transmitida e refletida são computados e exibidos em letras vermelhas. Para selecionar outra ampliação, use o menu suspenso Ampliação para escolher um objetivo no intervalo entre 10x e 100x. Note que em aberturas e ampliações numéricas mais baixas, a intensidade de iluminação transmitida é maior do que a observada com o mesmo objetivo na luz refletida. Esses valores se invertem em aberturas e ampliações numéricas mais altas, com as intensidades de luz refletida se tornando muito maiores do que as observadas na luz transmitida.
O brilho da imagem é diretamente proporcional à abertura numérica objetiva e inversamente proporcional ao quadrado da ampliação lateral:
μ de brilho da imagem (NA/M)2
onde NA é a abertura numérica objetiva e M é a ampliação. A razão dada na equação acima expressa o poder de captação de luz do objetivo na transiluminação (nota: o caso da epi-iluminação é um pouco diferente, como discutido abaixo). Em geral, objetivas com aberturas numéricas altas também são mais bem corrigidas para aberrações. Assim, para a mesma ampliação, objetivas de maior abertura numérica coletam mais luz, produzem uma imagem mais brilhante e melhor corrigida, e a imagem geral é melhor resolvida.
Quando uma objetiva é usada na transiluminação, o brilho da imagem diminui rapidamente à medida que a ampliação aumenta. Em contraste, a utilização de um objetivo específico para epi-iluminação produz imagens cada vez mais brilhantes à medida que a ampliação aumenta. Os termos F(trans) e F(epi) referem-se ao poder de captação de luz de um objetivo e foram calculados de acordo com as seguintes equações:
F(trans) = 104 • NA 2/M2
F(epi) = 104 • (NA 2/M)2
Em teoria, a intensidade da iluminação depende do quadrado da abertura numérica do condensador e do quadrado da desampliação da imagem da fonte de luz (com efeito, a imagem do diafragma de campo torna-se mais brilhante à medida que se torna menor, de acordo com a lei do quadrado). O resultado é que o brilho da imagem do espécime é diretamente proporcional ao quadrado da abertura numérica objetiva ao atingir a ocular (ou sistema de câmera), e também inversamente proporcional à ampliação objetiva. Portanto, ao examinar corpos de prova em luz transmitida, a alteração da objetiva sem alterar o condensador afeta o brilho da imagem em resposta a mudanças na abertura numérica e ampliação.
Como discutido acima, os microscópios de fluorescência que utilizam epi-iluminação são equipados com objetivas que servem ao duplo propósito de condensador e objetivo. A luz que passa pelo filtro de excitação e refletida da superfície do espelho dicromática no cubo do filtro é primeiramente passada através da objetiva para formar um cone invertido de iluminação necessário para excitar o espécime. A fluorescência secundária emitida pelos fluoróforos ligados ao espécime é então coletada pelo mesmo sistema de lente objetiva e passada de volta através do espelho dicromática e do filtro de barreira antes de ser projetada nas oculares ou no sistema de imagem. Uma objetiva de alta abertura numérica atuando como um condensador aumentará a intensidade do sinal (luz) de forma proporcional ao quadrado da abertura numérica. Como o poder de captação de luz da objetiva também é proporcional à abertura numérica ao quadrado, o brilho da imagem variará como a quarta potência da abertura numérica da objetiva de acordo com a equação:
Brilho da imagem (fluorescência) ∝ NA4/M2
Note que na microscopia de fluorescência, o brilho também é inversamente proporcional à ampliação objetiva ao quadrado. Assim, para objetivos de ampliação idêntica, o brilho da imagem tanto do campo de iluminação quanto da imagem de fluorescência aumenta drasticamente com a abertura numérica objetiva, que é a principal razão pela qual os fabricantes produzem objetivos projetados com aberturas numéricas muito altas para microscopia de fluorescência.
As oculares empregadas para observar o espécime ampliam ainda mais a imagem limitada por difração projetada no plano intermediário da imagem do microscópio e também servem para diminuir a intensidade geral observada do espécime. De fato, o brilho da imagem é inversamente proporcional ao quadrado da ampliação da ocular, exigindo o uso de oculares com a menor ampliação possível necessária para observar convenientemente a fluorescência da amostra. Portanto, é possível maximizar o brilho da imagem em microscopia de fluorescência usando a objetiva de abertura numérica mais alta disponível acoplada às oculares de menor potência (embora oculares de 10x sejam mais comumente empregadas). Essas observações se aplicam principalmente a grandes áreas de espécimes que têm um grau uniforme de iluminação. No caso de fontes de luz pontiagudamente focadas (por exemplo, esferas fluorescentes diminutas), as imagens de partículas devem ser limitadas por difração e ter dimensões independentes da ampliação.
Aumentando o sinal da amostra
Na microscopia de fluorescência, o brilho da imagem é determinado pela intensidade da iluminação, pelo rendimento quântico do fluoróforo e pelo poder de captação de luz do microscópio. Quanto maior a intensidade da iluminação e quanto maior o rendimento quântico, maior o sinal fluorescente e mais brilhante a imagem se torna até que todos os fluoróforos estejam saturados. Da mesma forma, na luz polarizada, o brilho da imagem é governado pela intensidade de iluminação e retardo de birrefringência do espécime. Em valores de até um quarto de comprimento de onda de retardo, retardos maiores produzem uma birrefringência maior e, portanto, um sinal mais forte.
Em ambos os casos, o brilho da imagem é controlado pelo sinal do espécime, que é um produto da intensidade da iluminação e da mudança na luz introduzida pelo espécime. No caso da luminescência, onde os próprios espécimes emitem luz, o brilho da imagem é claramente governado pela magnitude da luz, ou o sinal, emitido pelo espécime.
Esse conceito é ilustrado nas Figuras 3 e 4 para amostras de fluorescência e luz polarizada, respectivamente. A Figura 3 apresenta um par de imagens digitais de uma fina seção fina da folha de oleandro tiradas sob condições de epi-iluminação em um microscópio estéreo equipado com um iluminador de fluorescência. Quando a seção fina é excitada com um conjunto de filtros de proteína de fluorescência verde Endow (GFP) com uma faixa de passagem de banda entre 450 e 490 nanômetros, o espécime exibe uma autofluorescência verde fraca (Figura 3(a)) que é altamente visível em algumas porções do espécime, mas muito fraca em outras. Em contraste, a excitação do espécime com um conjunto de filtros passa-banda de comprimento de onda mais longo (530-560 nanômetros; A Figura 3(b)) produz uma autofluorescência vermelha brilhante com um sinal muito mais forte em toda a seção fina.
Situação semelhante é observada com a microscopia de luz polarizada de cortes finos de minerais, como ilustrado na Figura 4. O espécime é uma seção polida de 30 mícrons de anortosita, uma rocha ígnea composta quase inteiramente de feldspato. Quando a fina seção birrefringente altamente orientada é posicionada com os eixos ópticos perpendiculares ao polarizador, a luz (o sinal) que passa pelo analisador é minimizada (Figura 4(a)). No entanto, quando os eixos ópticos estão orientados em um ângulo de 45 graus em relação ao analisador e polarizador (Figura 4(b)), a quantidade máxima de luz é recebida pelas oculares ou sensor de imagem.
Em outros modos de microscopia, como contraste de fase, contraste de interferência diferencial (DIC), campo escuro, contraste de modulação de Hoffman, etc., a intensidade de iluminação e o contraste da imagem podem ser variados independentemente. No entanto, o sinal da imagem, ou seja, o incremento do brilho da imagem por unidade de variação em um parâmetro óptico (por exemplo, uma diferença no comprimento do caminho), ainda seria determinado pelo produto da intensidade da iluminação e do contraste produzido por unidade de variação no parâmetro óptico. Para detectar pequenas variações em qualquer parâmetro óptico, o microscopista deve maximizar o sinal decorrente de variações nesse parâmetro específico.
Transmissão de Luz Através do Microscópio
Para um determinado condensador e abertura numérica objetiva, ampliação e brilho do iluminador, o brilho da imagem produzido pelo microscópio ainda pode variar dependendo da transmissão de luz através dos componentes ópticos. A transmissão de luz depende de vários fatores, incluindo absorção por elementos de lente e cimentos, perdas de reflexão nas interfaces ópticas e transmitâncias da camisa da lâmpada, tela de difusão, filtros, polarizadores e outros componentes ópticos auxiliares. As curvas de transmissão típicas para um conjunto selecionado de objetivas de alta abertura numérica são ilustradas na Figura 1. Esses valores são mais ou menos representativos de qualquer classe de objetivos de um determinado fabricante, mas mesmo entre os tipos específicos para os quais essas curvas foram medidas, os valores exatos de transmissão podem variar um pouco dependendo, por exemplo, do revestimento antirreflexo e do lote de vidro usado em lentes individuais.
A transmitância (intensidade transmitida como uma porcentagem da intensidade incidente) de alguns componentes ópticos pode ser dependente do comprimento de onda mesmo dentro da faixa visível, como mostrado na Figura 1. Além disso, em comprimentos de onda fora da faixa visível, as transmitâncias de lentes, prismas, lâminas e o meio de montagem para o espécime podem cair sensivelmente. Esse fato é exemplificado pela curva de transmissão objetiva de flúor plano de 20x ilustrada na Figura 1, que mostra uma diminuição constante na transmitância à medida que o comprimento de onda é aumentado entre 400 e 700 nanômetros. Outros objetivos da série não exibem um grau tão acentuado de dependência do comprimento de onda.
Mais de 200 formulações de vidro óptico já foram desenvolvidas e estão disponíveis para o projetista óptico para incorporação em lentes de microscópio, espelhos, filtros e divisores de feixe. As propriedades desses vidros, como índice de refração, dispersão, transmissão, contaminantes, potencial de autofluorescência, resistência química e térmica e homogeneidade geral são geralmente cuidadosamente selecionadas para garantir o máximo desempenho óptico. No entanto, esses fatores frequentemente comprometem outros requisitos, como alta transmissão na faixa do ultravioleta próximo ou altos fatores de extinção na microscopia polarizante. Alguns novos materiais, como o vidro fluorocrown, abordam as propriedades da fluorita natural, evitando a maioria de seus inconvenientes, como a presença de contaminantes orgânicos e uma microestrutura cristalina, que pode degradar seriamente o desempenho em fluorescência e microscopia polarizante. A correção totalmente apocromática, no entanto, ainda requer fluorita natural e vidros que têm transmissão reduzida na faixa ultravioleta próxima. Um compromisso ideal é muitas vezes a objetiva semi-apocromática ou fluorita, que é uma verdadeira objetiva multiuso, combinando excelente correção com bom contraste, altos valores de abertura numérica e um alto rendimento de espectros.
Embora as espessuras do cimento óptico sejam em média de apenas cerca de 10 mícrons ou menos, os cimentos colocados entre elementos duplos ou múltiplos de lente podem ter propriedades de absorção espectral que podem tornar um objetivo inadequado para aplicações específicas. Na maioria dos casos, as propriedades químicas e ópticas dos vidros ópticos, e alguns cimentos ópticos, são geralmente proprietárias.
Todas as superfícies nas interfaces vidro-ar refletem alguma luz e resultam em perda de transmissão, mesmo quando não há absorção de luz e o feixe é incidente normal à interface. À medida que o ângulo de incidência aumenta, as perdas de reflexão e transmissão aumentam de forma dependente da orientação das direções das vibrações das ondas de luz (perpendiculares ou paralelas ao plano de incidência). Cada interface ar-vidro não revestida pode refletir entre quatro e cinco por cento de um feixe de luz incidente perpendicularmente à superfície (ver Figura 5). A transmitância por passagem através de uma interface não tratada seria, portanto, de 95 a 96 por cento na incidência normal. Ao aplicar um revestimento antirreflexo (geralmente um filme de interferência de um quarto de onda com um índice de refração apropriado), a reflexão da luz nas superfícies de vidro pode ser reduzida para um por cento ou menos para uma faixa moderada de comprimentos de onda e ângulos de incidência, como ilustrado na Figura 5 para uma faixa de comprimento de onda entre 400 e 850 nanômetros.
Foram desenvolvidos revestimentos antirreflexo multicamadas, que podem reduzir a reflexão em uma interface ar-vidro a valores tão baixos quanto 0,1% em uma faixa ainda maior de comprimentos de onda. A maioria dos revestimentos de interferência multicamadas comumente utilizados tem uma tonalidade ligeiramente esverdeada, em oposição à tonalidade arroxeada dos revestimentos de camada única, tornando-os mais fáceis de identificar. Alguns revestimentos antirreflexo, especialmente os multicamadas, comportam-se anisotropicalmente para ondas incidentes não normais e podem reduzir drasticamente o fator de extinção em sistemas ópticos dependentes da polarização.
À medida que a sofisticação objetiva aumenta, mais elementos de lente são necessários, e isso acentua a necessidade de eliminar os reflexos internos para produzir maior transmissão, melhor contraste e menos flare. Essas propriedades são particularmente importantes para aplicações de luz incidente ou refletida. Revestimentos antirreflexo de camada única que datam da década de 1940 foram refinados e complementados por revestimentos multicamadas, aumentando a transmissão na faixa espectral visível através de uma interface ar-vidro de cerca de 96% (não revestida) para quase 99,9% (utilizando revestimentos multicamadas, conforme descrito acima e ilustrado nas Figuras 4 e 5). A Figura 6 ilustra os efeitos das reflexões múltiplas sobre superfícies de vidro com índices de refração de 1,5 e 1,8 (desenhos superior e inferior, respectivamente). No índice de refração mais baixo (1,5), os oito elementos com suas 16 superfícies, cada um refletindo aproximadamente quatro por cento da luz incidente, resultam em um rendimento de apenas 52 por cento. Em contraste, os elementos de vidro de maior índice de refração (1,8), as 16 superfícies não revestidas passarão apenas 26% da luz incidente. O revestimento antirreflexo de camada única aumenta a transmissão para 85%, enquanto o revestimento multicamada aumenta esse valor para cerca de 94,6%. Esse aumento na taxa de transferência e a correspondente redução na dispersão interna e no ruído melhoram substancialmente o contraste de uma imagem, pois torna os recursos brilhantes mais claros e os recursos escuros mais escuros.
Os materiais de revestimento são fluoreto de magnésio ou uma infinidade de materiais proprietários, todos os quais têm suas próprias propriedades ópticas potencialmente afetando a transmissão do sistema óptico em determinadas regiões espectrais. Em geral, as características de interferência dos revestimentos antirreflexo são limitadas espectralmente, e interferência construtiva para alta transmissão na faixa visível significa interferência destrutiva em frequências harmonicamente relacionadas fora da banda de transmissão.
A maioria das objetivas modernas de alta abertura numérica com um alto grau de correção para aberração óptica contém até 15 elementos de lente individuais e até 10-12 interfaces ar-vidro. Se as lentes não fossem revestidas, as perdas de reflexão dos raios axiais por si só reduziriam a transmitância dessas objetivas para cerca de 50%. Com todas as superfícies revestidas usando filmes de interferência de camada única ou multicamada, a transmitância pode ser melhorada para cerca de 86 a 90 por cento.
Além dos elementos de lente encontrados nas objetivas, pode haver entre duas e quatro dúzias de interfaces vidro-ar no trem óptico dos microscópios modernos:
Lamphouse e coletor - 4-6 elementos de lente individuais
Trem óptico interno - 2-8 espelhos, prismas e lentes de relé
Filtros - 2-8 unidades em transmissão ou epifluorescência
Beamsplitters - 1-4 unidades em tubos de observação e sistemas de câmeras
Condensadores - 4-8 lentes, dependendo da correção óptica
Espécime - 0-4 incluindo a corrediça e a lamínula
Oculares - 4-6 dependendo da correção óptica e design
Sistema de câmera - 2-6 lentes, espelhos e elementos filtrantes
Em casos extremos, pode haver até cinco dúzias de interfaces ópticas quando o objetivo é incluído. Menos de 9% dos raios axiais seriam transmitidos através de um microscópio com 60 interfaces não revestidas, e pouco mais de 50% com todas as superfícies revestidas.
Revestimentos de lentes de alta qualidade são essenciais não apenas para melhorar a transmissão de luz através do microscópio, mas também para diminuir o flare devido a múltiplas reflexões nas superfícies de vidro. No entanto, mesmo os melhores revestimentos não funcionarão além de uma determinada faixa de comprimento de onda. Para alguns comprimentos de onda, o revestimento pode até aumentar a refletância (uma película de interferência de meia onda é um refletor perfeito). Este é um ponto importante a ter em mente para imagens digitais com câmeras CCD, fotodiodos, fotomultiplicadores ou sensores de vídeo, onde a sensibilidade do fotodetector pode atingir o pico em comprimentos de onda muito distantes do olho humano.
Além das perdas de reflexão nas interfaces ópticas, o bloqueio da transmissão de luz através da camisa da lâmpada pode reduzir o brilho da imagem. À medida que a lâmpada envelhece, a camisa de vidro ou quartzo pode enlouquecer ou escurecer à medida que se desvia ou se torna revestida ou permeada por metal atomizado evaporando do filamento ou eletrodos. Vale ressaltar que a transmitância da camisa da lâmpada pode cair mais cedo no ultravioleta do que nas regiões visíveis. Neste caso, o brilho visível, ou luminância medida com um fotômetro, pode ser um indicador ruim da saída ultravioleta de lâmpadas de arco de mercúrio ou xenônio.
Uma tela difusora de vidro fosco transmite apenas 10 a 15 por cento da luz viajando dentro de três por cento de seu normal. Ainda menos luz é transmitida em ângulos incidentes oblíquos. Assim, difusores de vidro fosco devem ser evitados sempre que o nível de iluminação deva ser maximizado.
Filtros e espelhos dicromatômicos têm transmissões que caem à medida que a banda de passagem é estreitada. Muitos filtros de interferência transmitem apenas 15 a 30 por cento da energia incidente no comprimento de onda para transmissão de pico. No entanto, alguns filtros de interferência multicamadas selecionados com larguras de banda de meia transmissão tão estreitas quanto 50 angstroms podem fornecer transmitância de pico de 75% ou mais.
Os filtros polarizadores usados em óptica de polarização e contraste de interferência diferencial (DIC) também podem reduzir substancialmente a transmissão de luz através do microscópio. Mesmo quando os eixos do polarizador e do analisador são ajustados para uma posição paralela no pico de transmissão, a transmitância de um conjunto de filtros polarizadores, cada um com uma transmitância de luz natural de 20%, é de apenas cerca de 8%. Em contraste, prismas de calcita de alta qualidade com placas de cobertura revestidas com antirreflexo podem transmitir o máximo teórico de cerca de 50% da luz não polarizada incidente por par.
A Figura 7 é apresentada uma ilustração dos elementos internos da lente em um moderno microscópio óptico configurado para iluminação e observação de luz transmitida e refletida. Observe o grande número de interfaces vidro-ar presentes na base do microscópio entre a lâmpada e a lente de campo e um número semelhante no iluminador vertical. Há também um grande número de interfaces nas janelas, prismas e lentes dos tubos de observação e oculares, bem como os conjuntos de nariz e condensador.
Como discutido acima, uma variedade de fatores pode limitar a transmissão de luz através dos muitos componentes ópticos de um microscópio moderno. Quando se está se esforçando para obter a mais alta resolução, especialmente em modos de realce de contraste onde a imagem é inerentemente fraca, todos os fatores listados anteriormente devem ser examinados cuidadosamente. Deve-se reiterar que a transmitância através de todo o microscópio é determinada pelo produto das transmitâncias de todos os componentes ópticos.
Brilho da Iluminação
Em um microscópio equipado com um iluminador bem corrigido (incluindo o sistema de lentes coletoras) e lentes condensadoras, o grau de iluminação (iluminância) do campo sob condições de iluminação Köhler é governado por uma série de fatores, incluindo o brilho intrínseco (densidade luminosa média) da fonte de luz e a distância focal da lente coletora para a fonte de luz. Além disso, a abertura numérica do sistema de lentes do condensador, a configuração do tamanho de abertura do diafragma da íris da abertura do condensador e a transmitância geral do sistema de iluminação ajudam a controlar o grau de iluminação.
Sob a iluminação de Köhler, a luz que emana de cada ponto da fonte ilumina uniformemente o diafragma do campo do microscópio para produzir um campo de iluminação brilhante e uniformemente distribuído (dependendo da natureza da fonte de luz). Portanto, o tamanho da abertura no diafragma do campo afeta apenas o diâmetro do campo iluminado e não seu brilho.
Desde que a distância focal da lente coletora não seja muito curta para projetar uma imagem da fonte que cubra toda a abertura do diafragma da íris do condensador, o poder de coleta, ou valor f (diâmetro/distância focal) da lente não afeta a iluminância do campo. A densidade luminosa média da fonte de luz e o quadrado da abertura numérica do condensador determinam a iluminância do campo, desde que a abertura da íris do condensador seja preenchida com a imagem da fonte de luz. O poder de coleta da lente coletora e o tamanho da fonte de luz afetam a iluminância do campo somente se a imagem da fonte não cobrir toda a abertura do condensador.
Em resumo, a densidade luminosa média (a saída de luz por unidade de área da fonte) determina o brilho da imagem, não a saída total de luz, o fluxo luminoso ou a área da fonte de luz. O fluxo luminoso da fonte é o produto da densidade luminosa e da área da fonte, com esta última desempenhando apenas um papel secundário na determinação da densidade luminosa média. Como a densidade luminosa da fonte limita a iluminância do campo, a luminância da imagem nunca pode exceder a densidade luminosa da fonte. Em outras palavras, o campo nunca pode ser mais brilhante do que a fonte, não importa quais arranjos inteligentes e combinações de espelhos, prismas, lentes ou outros componentes sejam empregados no trem óptico. A Tabela 2 lista várias fontes de iluminação com densidade luminosa relativamente alta que são úteis em microscopia óptica e inclui especificações como fluxo luminoso, tamanho do arco e densidade luminosa média.
Deve-se notar que muitas lâmpadas de arco concentrado (mercúrio e xenônio) fornecem um grau muito alto de densidade luminosa, e têm um grau altamente não uniforme de distribuição de luz ao longo do arco. Comumente, o arco é mais brilhante em um ponto minúsculo adjacente a um dos eletrodos, mesmo dentro de arcos cujas dimensões totais são pequenas (tão baixas quanto 0,3 × 0,3 milímetros). Quando a imagem de tal arco é projetada na abertura do condensador, não há mais uma distribuição uniforme da intensidade de iluminação. Assim, o padrão de difração produzido por cada ponto do corpo de prova se afasta do disco Airy ideal. No entanto, estas lâmpadas de arco são essenciais para certas aplicações em microscopia (principalmente fluorescência) devido à alta densidade luminosa média. Um remédio para esta situação é empregar uma única fibra óptica (não um feixe de fibras) scrambler de luz que pode ser adicionado ao microscópio sem perda apreciável de iluminância média. A Figura 8 ilustra uma imagem de fluorescência no plano focal traseiro objetivo em uma situação em que a iluminação do campo não é uniforme devido à distribuição desigual da intensidade da iluminação. Na Figura 8(a) a imagem do espécime é uniformemente iluminada e projetará uma imagem aceitável no sensor. Por outro lado, na Figura 8(b), o espécime não está devidamente iluminado em todo o campo de visão e resultará em uma imagem que tem um grau significativo de flutuação na intensidade.
O condensador de subestágio do microscópio é um elemento crítico na determinação da qualidade e do grau de iluminação fornecido ao espécime. Alguns condensadores de microscópio podem ser empregados com e sem um meio de imersão entre a lente superior do condensador e a lente frontal objetiva. Mais frequentemente, condensadores de alta qualidade são projetados para serem usados com um meio de imersão específico, tendo um índice de refração e dispersão específicos. O meio, que pode ser óleo, glicerol, água ou ar, preenche o espaço entre o elemento da lente superior do condensador e a superfície inferior da lâmina da amostra.
A maioria dos campos escuros, e algum contraste de fase, contraste de interferência diferencial (DIC) e óptica de luz polarizada requerem que o condensador seja imerso para alcançar uma alta abertura numérica do condensador. Os condensadores são projetados para um ótimo desempenho e mínima aberração quando o meio de imersão correto com um índice de refração e dispersão definidos é utilizado. A imersão dispensa a perda de luz além do ângulo crítico, elimina a refração adicional, minimiza as perdas de reflexão da luz e reduz o número de interfaces ópticas que podem espalhar ou refletir a luz em altos ângulos de incidência. Tal espalhamento e reflexão tornam-se uma fonte de flare, e também alteram o estado da luz polarizada, reduzindo assim a extinção em sistemas ópticos de polarização de alta abertura numérica. Em resumo, a imersão do condensador afeta a iluminância do campo, bem como a qualidade da imagem. Para alcançar o máximo desempenho, os condensadores projetados para serem imersos devem ser imersos com o meio correto.
Embora a iluminância do campo aumente com o quadrado da abertura numérica do condensador, abrir o diafragma da íris do condensador muito além da abertura numérica objetiva correspondente produz flare. Além disso, a parte da iluminação que erra a abertura objetiva produz uma imagem de campo escuro sobreposta à imagem de campo claro, reduzindo assim o contraste da imagem.
Conclusões
A área exposta em um sensor de vídeo ou plano de filme fotográfico no microscópio óptico é proporcional ao quadrado da magnificação, como discutido acima. O brilho da imagem, portanto, diminui com o quadrado da ampliação. Em geral, microscópios são utilizados para expor os detalhes finos em um espécime, mas, ao mesmo tempo, o microscópio é um potente instrumento de coleta de luz. Assim como um telescópio ou binóculo melhora nossa visão à noite, o poder de captação de luz do microscópio pode ser efetivamente empregado para capturar a imagem de objetos fracamente iluminados.
Dependendo das características do espécime que devem ser visualizadas, a imagem pode se tornar mais significativa se mais luz for coletada, em vez de aumentar a ampliação. Para um número de espécimes luminescentes e fluorescentes, o nível de luz pode ser tão baixo que uma imagem altamente ampliada se torna invisível ou indetectável e, portanto, totalmente sem sentido. Nesses casos, a imagem pode tornar-se mais inteligível coletando mais luz, integrando a luz ao longo do tempo (se o espécime for estático), ou reduzindo a ampliação da imagem.
Para situações de nível de luz extremamente baixo, pode-se maximizar o brilho da imagem usando a objetiva de abertura numérica mais alta disponível na menor ampliação geral. Em alguns casos, é até benéfico usar o ocular para reduzir, em vez de aumentar, a ampliação da imagem intermediária.
Em um esforço para combinar a resolução do sensor com o poder de resolução do objetivo, há uma tendência geral de aumentar a ampliação da imagem projetada no sensor CCD ou dispositivo de captação de vídeo. Como o brilho da imagem cai pelo quadrado da ampliação e o sensor só pode funcionar dentro de uma faixa restrita de intensidades, aumentar a ampliação pode resultar no nível de brilho caindo abaixo da sensibilidade do sensor. Se a amostra estiver estacionária ou mudar muito lentamente, a relação sinal-ruído pode ser drasticamente melhorada integrando a imagem ao longo de vários tempos de quadro, seja somando ou fazendo a média do sinal, ou melhor ainda, integrando fotoelétrons no próprio sensor. Neste caso, a resolução temporal é sacrificada para melhorar a informação espacial. Independentemente disso, muitas vezes há um cabo de guerra, e compromisso, entre tentativas de aumentar a resolução e tentativas de reduzir o nível de ruído, que aumenta dramaticamente à medida que a imagem fica mais fraca. Quando o brilho da imagem é limitado, o microscopista deve ajustar cuidadosamente a ampliação do instrumento para atingir o melhor equilíbrio.
Autores Contribuintes
Microscopia - Brilho e Imagem
Mortimer Abramowitz - Olympus America, Inc., Two Corporate Center Drive., Melville, Nova Iorque, 11747.
Michael W. Davidson - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., Universidade do Estado da Flórida, Tallahassee, Flórida, 32310.
