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Iluminação - Köhler Iluminação em Luz Transmitida

Iluminação - Köhler Iluminação em Luz Transmitida: O ajuste de um microscópio de luz transmitida para iluminação Köhler é um processo lógico e relativamente fácil que deve ser praticado até ser dominado por todos os estudantes sérios de microscopia. Cada vez que um microscópio é ligado, ele deve ser cuidadosamente inspecionado para garantir o alinhamento adequado de todos os componentes ópticos e para garantir que a lâmpada esteja centralizada e o condensador e o diafragma de campo estejam devidamente ajustados para a iluminação Köhler.

O microscópio ilustrado na Figura 1 utiliza uma fonte de luz externa avançada para fornecer iluminação para o microscópio. A carcaça da lâmpada contém um diafragma de campo e uma lente coletora, além de uma lâmpada de tungstênio-halogênio. Um regulador de tensão separado fornece uma fonte de tensão de corrente contínua ajustável para a lâmpada que varia entre 5 e 12 volts. Microscópios modernos geralmente contêm uma fonte de luz embutida na base do microscópio, juntamente com a lente coletora e diafragma de campo. O ajuste de microscópios com fontes de luz internas ou externas para iluminação Köhler é semelhante na teoria, porém existem algumas diferenças nos procedimentos que serão descritos a seguir.

Um passo importante no alinhamento do microscópio, seja para Köhler, Nelsonian, ou qualquer outra estratégia de iluminação, é o alinhamento da fonte de luz (geralmente uma lâmpada de tungstênio-halogênio). Muitos microscópios modernos agora têm lâmpadas pré-centradas e pré-focadas, mas modelos mais antigos ainda exigem que a fonte de luz seja centralizada e focalizada pelo usuário. Sugerimos consultar o manual do proprietário para obter instruções sobre como a lâmpada deve ser centralizada e para outras informações importantes sobre a fonte de iluminação. Os seguintes procedimentos são recomendados para alinhar lâmpadas externas e internas:

Lâmpadas internas de tungstênio-halogênio

Depois de ligar a lâmpada do microscópio, abra totalmente o diafragma de campo (geralmente perto da porta de luz do microscópio) e o diafragma da abertura do condensador (controlado por um colar ou alça na carcaça do condensador de subestágio).
Alguns fabricantes fornecem um filtro de vidro fosco para difundir a luz emitida pela lâmpada. Este filtro está geralmente localizado em um suporte de filtro adjacente à carcaça da lâmpada, onde está ligado ao corpo do microscópio. Remova este filtro antes de prosseguir com o alinhamento da lâmpada.
Coloque uma folha de papel branco, vidro fosco, lenço de Kim ou lenço de limpeza da lente na porta do microscópio e a imagem do filamento será claramente visível, conforme ilustrado na Figura 2.

Use os parafusos de ajuste na carcaça da lâmpada para girar a lâmpada (portanto, o filamento) em seu suporte e também para movê-la para frente e para trás ou para cima e para baixo. A manipulação correta da combinação de ajustes da carcaça da lâmpada deve garantir que o filamento da lâmpada esteja centralizado no caminho óptico e focado no diafragma de abertura do condensador de subestágio.

A Figura 3 ilustra uma visão típica da porta de luz do microscópio quando o filamento é tornado visível usando os procedimentos descritos acima. A porta à esquerda na Figura 3(a) contém um filamento que está severamente desalinhado, e não posicionado adequadamente para focalizar uma imagem que preencherá completamente o diafragma de abertura nem o plano focal posterior da objetiva. Usando ajustes translacionais na carcaça da lâmpada, o filamento é colocado em foco (Figura 3(b)) e, em seguida, centralizado dentro da porta de luz (Figura 3(c)). Visitantes e alunos podem praticar o alinhamento de um filamento de lâmpada "virtual" usando o tutorial interativo em Java abaixo:

Lâmpadas externas de tungstênio e tungstênio-halogênio

A maioria das fontes de luz externas são mais antigas e não possuem lâmpadas pré-centradas. O primeiro passo para centralizar uma lâmpada externa de tungstênio-halogênio é projetar uma imagem do filamento em uma folha de papel distante, apoiada por um livro ou pela parede. Use os parafusos ou botões de ajuste para girar o filamento em torno de seu próprio eixo e garantir que ele esteja centralizado dentro do eixo óptico da lente do condensador e do diafragma de campo, que são parte integrante da fonte de iluminação externa.
Coloque o iluminador externo a cerca de 7-10 polegadas de distância do espelho refletor localizado na base do microscópio diretamente abaixo do condensador de subestágio (veja a Figura 1). Muitos dos espelhos em microscópios projetados para fontes de luz externas são plano-côncavos e têm um lado plano (plano) e um côncavo. Certifique-se de que a fonte de luz está refletindo da superfície plana do espelho ao usar uma fonte de luz externa de tungstênio-halogênio.

filamento da lâmpada deve estar centralizado no espelho como ilustrado na Figura 4 — Figura 4

O filamento da lâmpada deve estar centralizado no espelho como ilustrado na Figura 4. Isso pode ser verificado de maneira análoga à lâmpada interna, colocando um pedaço de papel de seda sobre o espelho e visualizando onde a imagem do filamento é projetada. Faça os ajustes necessários para alinhar o iluminador externo com o eixo óptico do microscópio. Após a centralização do filamento, o espelho deve ser posicionado para projetar a reflexão no condensador de subestágio. Verifique isso colocando um pedaço de papel de seda sobre a abertura do palco. O filamento deve estar fora de foco, mas enquadrado diretamente no centro da abertura do palco.

Alinhamento do Condensador e Diafragma de Campo

Gire o nariz para trazer a objetiva de 10x para o caminho da luz. Em seguida, coloque o espécime no estágio do microscópio e foque o microscópio usando os botões de focalização grossos e finos. Isso deve ser feito levantando lentamente o estágio do microscópio enquanto visualiza a lâmina até que ela esteja muito próxima (mas não tocando!) da objetiva. Neste ponto, o estágio terá que ser ligeiramente abaixado para trazer o espécime em foco. Trata-se de um conceito importante que, quando bem conduzido, evitará uma colisão entre o objetivo e o deslizamento da tampa do corpo-de-prova. Olhe através das oculares e abaixe lentamente o palco, usando o botão de foco fino, até que os detalhes do espécime entrem em foco. O espécime deve possuir amplo contraste e fornecer uma imagem nítida e nítida. Uma amostra de tecido biológico altamente corada é excelente para alinhar o microscópio no modo de campo claro, no entanto, amostras opticamente birrefringentes também podem ser usadas quando o microscópio está equipado para luz polarizada ou contraste de interferência diferencial.

Em microscópios binoculares, ajuste os tubos oculares para coincidir com sua distância interpupilar. A imagem única fundida deve ser visível através de ambos os olhos, sem movimento significativo da cabeça, e a visualização deve ser confortável. Se apenas uma pessoa usa o microscópio, esse ajuste não deve ser feito com muita frequência. Muitas cabeças binoculares possuem uma escala graduada (Figura 5) que corresponde ao tamanho da distância interpupilar, permitindo ao microscopista ajustar rapidamente os tubos oculares sem visualizá-los (a distância interpupilar média é de 65 milímetros).

cabeças binoculares possuem uma escala graduada — Figura 5

Nos microscópios modernos, os tubos oculares são ajustados de maneira semelhante a um par de binóculos. No entanto, em muitos modelos mais antigos, os tubos oculares deslizam para frente e para trás em um único plano e ajustá-los pode envolver pequenas mudanças no comprimento do tubo do microscópio. Independentemente do mecanismo de translação, os tubos devem ser posicionados a uma distância que permita uma visualização confortável. Em seguida, gire a lente ocular da ocular que contém a régua graduada ou fotomicrografia até que as marcas no retículo apareçam em foco nítido sobreposto a um espécime focado. Se nenhum retículo estiver presente, gire a lente ocular até que a amostra esteja em foco.
O ajuste dióptrico deve ser feito nas oculares individualmente. Alguns microscópios têm uma escala graduada em cada ocular que indica a posição da lente em relação ao corpo principal da ocular. Outros modelos seguram o corpo da ocular em uma posição fixa firmemente no tubo do olho com um pino e fenda. O primeiro passo é alinhar as marcações graduadas nas oculares equipadas com essas marcações ou girar as lentes oculares no sentido horário para a posição de distância focal mais curta. Em seguida, focalize o espécime com a objetiva de 10x e, em seguida, gire a peça nasal até que uma objetiva de aumento inferior (geralmente a 5x) esteja acima da amostra. Neste ponto, redirecione cada lente ocular individualmente (não use os mecanismos de foco grosso ou fino do microscópio) até que o espécime esteja em foco nítido. Gire a objetiva de 20x no caminho óptico e redirecione o microscópio com o botão de foco fino. Repita os ajustes da lente do olho diopter com a objetiva de 5x (novamente não perturbando o mecanismo de foco fino do microscópio) e o microscópio deve ser ajustado para as configurações corretas de dioptrias. Essas configurações variam de usuário para usuário, portanto, registre a posição das lentes oculares se a ocular tiver uma escala graduada para retorno rápido ao ajuste adequado.
O ajuste correto da dioptria permite a compensação entre quaisquer diferenças no olho esquerdo e direito do usuário, de modo que todo o campo de visão apareça em foco nítido através de ambas as oculares. Isso também permite que o microscópio permaneça parfocal através de todas as diferentes objetivas na peça nasal. O ajuste dióptrico da ocular também pode compensar problemas comuns de visão, como visão para longe ou para perto, permitindo que o usuário visualize amostras sem óculos. No entanto, esses ajustes nas oculares não compensarão o astigmatismo, forçando os usuários com esse defeito ocular a usar seus óculos ao examinar espécimes.
O próximo passo é fechar lentamente o diafragma de campo (o ajuste é na carcaça externa da lâmpada ou na base do microscópio perto da porta de luz) para sua menor configuração até que apenas um contorno difuso apareça no campo de visão (Figura 6(a)). O condensador de subestágio é montado em um rack que é (normalmente) controlado por um botão retorcido para movimento para cima e para baixo em relação ao palco. Ajuste este botão até que as folhas do diafragma de campo estejam em foco nítido na parte superior da amostra já focalizada e, em seguida, use os parafusos de centralização do condensador para mover a imagem do diafragma de campo para o centro do campo de visão (e o eixo óptico do microscópio - Figura 6(b)).

O diafragma do campo é agora aberto até que cerca de três quartos do campo de visão seja visível e o condensador seja então refocalizado (Figura 6) — Figura 6

Ao elevar ou abaixar o condensador para focalizar as folhas do diafragma do campo, a imagem focalizada do diafragma pode ter um halo vermelho ou azul ao redor das folhas. Isso se deve à falta de correção para a aberração cromática no condensador. Um condensador com boa correção produzirá um contorno muito nítido do diafragma com pouca ou nenhuma cor. O diafragma do campo é agora aberto até que cerca de três quartos do campo de visão seja visível e o condensador seja então refocalizado (Figura 6(c)). Verifique o alinhamento do condensador e reajuste, se necessário. Agora abra o diafragma do campo até que ele esteja um pouco além do campo de visão (para observação), ou no caso da fotomicrografia, um pouco além das marcações de retículo que definem a área capturada no filme. Abrir o diafragma do campo é desnecessário e causará ofuscamento excessivo e perda de contraste.
O próximo passo é remover uma das oculares e espreitar o tubo do microscópio, como mostra a Figura 7(a). Ao visualizar o tubo, abra e feche o diafragma da abertura do condensador para ver sua imagem no plano focal traseiro da objetiva. Se houver um filtro difusor fosco embutido no caminho da luz na base do microscópio, um círculo de luz uniformemente iluminado será visível. Se não houver esse filtro no caminho da luz, você verá uma imagem do filamento da lâmpada como ilustrado na Figura 7(b) (um telescópio centralizador ou de fase inserido no lugar da ocular removida, ou uma lente Bertrand tornará esse ajuste mais fácil de ver).

O objetivo desta manobra é ajustar o tamanho do diafragma de abertura para maximizar o contraste da imagem e obter a melhor imagem possível do espécime sem introduzir perda de resolução devido a artefatos de refração e difração. Uma regra geral é definir o diafragma de abertura entre 60 e 90 por cento do tamanho de todo o disco de luz visto no tubo da ocular.

você verá uma imagem do filamento da lâmpada como ilustrado na Figura 7 — Figura 7

Em alguns casos, a borda do diafragma de abertura parcialmente fechada não é concêntrica com o plano focal traseiro iluminado da objetiva. Isso se deve a um desalinhamento do condensador de subestágio ou do objetivo, e o manual de instruções do fabricante deve ser consultado para o regime de centralização correto. Alguns microscópios são enviados com o diafragma de abertura em uma posição fixa e centralizada que é impossível de mudar no laboratório. Condensadores de campo escuro e contraste de fase geralmente sempre fornecerão um mecanismo de centralização devido ao aspecto crucial desta etapa na configuração de microscópios para esses métodos de iluminação. A abertura do condensador deve ser centralizada com uma objetiva de 40x ou 60x para evitar ter que recentralizar o diafragma com cada objetivo (objetivas de menor potência quase sempre cairão dentro de margens aceitáveis usando este método).

Agora que a iluminação Köhler foi estabelecida com a objetiva de 10x, deve-se ter em mente que a mudança para uma objetiva de maior potência exigirá um realinhamento dos diafragmas de campo e abertura. Por exemplo, se você mudar para a objetiva de 40x, terá que fechar um pouco o diafragma de campo e recentivá-lo (olhando para uma área menor do espécime). Além disso, o diafragma da abertura do condensador deve ser ligeiramente aberto (a objetiva de 40x tem uma abertura numérica maior do que a objetiva de 10x). Cada vez que um objetivo é alterado, ambos os diafragmas devem ser ajustados de acordo com os passos descritos acima.

A maioria dos condensadores de microscópio modernos tem uma lente superior que oscila para fora do caminho da luz para uso com objetivas de aumento de 5x e abaixo, como ilustrado na Figura 8 — Figura 8

As condições de iluminação Köhler não se aplicam em ampliações usando objetivas de menor potência (5x e abaixo). Ao se preparar para a microscopia de baixa magnificação, primeiro alinhe o microscópio e ajuste o caminho óptico para a iluminação adequada de Köhler usando a objetiva de 10x. A maioria dos condensadores de microscópio modernos tem uma lente superior que oscila para fora do caminho da luz para uso com objetivas de aumento de 5x e abaixo, como ilustrado na Figura 8. Outros modelos de condensadores têm lentes superiores que podem ser desaparafusadas ou têm uma torre giratória de lentes condensadoras para uso com objetivas de baixa e alta ampliação.

Quando a lente oscilante é removida do caminho óptico, o desempenho do condensador é radicalmente alterado e o diafragma de abertura não funciona mais para controlar a abertura numérica dos raios de luz iluminados. Para evitar vinhetas, o diafragma da abertura do condensador deve ser aberto para sua configuração mais ampla, e o contraste da amostra é controlado com o diafragma de campo, que agora controla a abertura numérica dos raios de luz iluminados.

Ao ajustar adequadamente o microscópio para a iluminação Köhler, o espécime será bem iluminado com luz uniforme e sem brilho, dando boa resolução de imagem e contraste. Para mais informações, consulte nossa seção sobre a teoria da iluminação de Köhler e/ou os fundamentos da iluminação de microscópios. Material de referência sobre iluminação de microscópios também pode ser encontrado em nossa bibliografia e na seção sobre recursos da web, que contém links para outros sites de microscopia.

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