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Os primeiros microscopistas dependiam de lâmpadas de óleo e luz solar natural para fornecer uma fonte externa de iluminação para seus microscópios primitivos (mas muitas vezes notavelmente precisos). Eles muitas vezes empregavam métodos bastante engenhosos de coletar luz, como reflexão de um grande quadro branco ou dispersão da luz solar em um dia nublado. Infelizmente, esses métodos não forneciam iluminação confiável e frequentemente a área de iluminação do campo excedia em muito a abertura numérica do objetivo, causando ofuscamento e inundação.
Os microscópios modernos geralmente têm uma fonte de luz integral que pode ser controlada em um grau relativamente alto. A fonte mais comum para os microscópios atuais é uma lâmpada incandescente de tungstênio-halogênio posicionada em uma caixa reflexiva que projeta luz através da lente do coletor e no condensador de subestágio. A tensão da lâmpada é controlada através de um reostato variável que é comumente integrado ao suporte do microscópio. Uma lâmpada iluminadora típica e uma carcaça são ilustradas na Figura 1. A lâmpada é uma lâmpada de tungstênio-halogênio que opera em uma tensão de corrente contínua (DC) de 12 volts e produz até 100 watts de energia para iluminação. A tensão da lâmpada é controlada por uma fonte de alimentação DC que é frequentemente embutida na carcaça do microscópio, com um botão de controle de tensão que geralmente é um potenciômetro montado em algum lugar no suporte do microscópio. Essas lâmpadas geram uma grande quantidade de calor durante a operação, e a carcaça é fornecida com várias camadas de dissipadores de calor para ajudar a dissipar o excesso de calor. A posição da lâmpada é controlada por uma série de botões na lateral da carcaça do iluminador ou é pré-centralizada especificamente para a carcaça. A luz do abajur é direcionada para a base do microscópio através de uma lente coletora (Figura 1) e, em seguida, frequentemente através de um difusor de vidro sinterizado antes de ser focalizada no diafragma de abertura do condensador.
Lâmpadas incandescentes - As lâmpadas incandescentes à base de tungstênio são a principal fonte de iluminação usada em microscópios modernos, com exceção daquelas destinadas a investigações de microscopia de fluorescência. Essas lâmpadas são radiadores térmicos que emitem um espectro contínuo de luz que se estende de cerca de 300 nanômetros a mais de 1200-1400 nanômetros, com a maior parte da intensidade do comprimento de onda centrada na região de 600-1200 nanômetros, conforme ilustrado na Figura 2. Seu projeto, construção e operação é simples, consistindo de uma lâmpada de vidro fechada preenchida com um gás inerte e contendo um filamento de fio de tungstênio que é energizado por uma corrente elétrica DC. As lâmpadas produzem uma enorme quantidade de calor e luz, mas a luz representa apenas 5 a 10 por cento de sua produção de energia. As lâmpadas de tungstênio (mas não o halogênio de tungstênio) são semelhantes em operação às lâmpadas domésticas comuns e, da mesma forma, tendem a sofrer vários inconvenientes, como uma diminuição da intensidade com a idade e um escurecimento do envelope interno à medida que o tungstênio evaporado é lentamente depositado. A temperatura de cor e luminância destas lâmpadas varia com a tensão aplicada, mas os valores médios variam de cerca de 2200 K a 3400 K. Quando essas lâmpadas são usadas em fotomicrografia com filme colorido, os microscopistas devem usar uma tensão de lâmpada que produza uma temperatura de cor correspondente à da emulsão de filme, geralmente em algum lugar na faixa entre 3150 K e 3250 K. Muitas vezes, a temperatura de cor deve ser ajustada para fotomicrografia, inserindo filtros no caminho da luz que equilibram a iluminação para a temperatura de cor da emulsão do filme.
Para operar o tutorial, use o controle deslizante para trazer o filamento para dentro e fora de foco, como seria feito em um microscópio real com o botão de foco. Coloque o cursor do mouse sobre a caixa de alinhamento e mova a pequena caixa interna dentro da caixa maior para posicionar o filamento no centro do campo de visão.
As lâmpadas de tungstênio variam amplamente em seu design e o conjunto diversificado de modelos oferecidos pelos fabricantes apresentam uma variedade de formas de envelope, dispositivos de montagem e arranjos de filamento. Uma seleção típica de lâmpadas de tungstênio usadas em microscopia óptica é ilustrada na Figura 3. A lâmpada na Figura 3(a) é um filamento de tungstênio quadrado de 6-12 volts com uma base de baioneta de bronze que é projetada para ser usada com a extremidade da lâmpada cilíndrica voltada para a lente do coletor. A lâmpada de envelope arredondado ilustrada na Figura 3(b) também tem uma base de baioneta de bronze, mas esta lâmpada de 6 volts menos potente pode ser posicionada para projetar a luz lateralmente ou de ponta. A lâmpada na Figura 3(c) também tem um envelope arredondado, mas é equipada com uma base de rosca de parafuso Edison. Com uma tensão de funcionamento entre 6 e 30 volts, esta lâmpada foi projetada para ser usada de ponta a ponta.
O bulbo ilustrado na Figura 3(d) é muito semelhante ao da Figura 3(a), com exceção de ter um envelope de vidro estendido. É equipado com uma base de baioneta de latão e é um projeto comum usado em uma série de microscópios construídos na Europa Oriental. Uma lâmpada moderna de tungstênio-halogênio (às vezes referida como uma lâmpada de quartzo-iodo) é ilustrada na Figura 3(e). Essas lâmpadas são agora equipamentos padrão na maioria dos microscópios fabricados no Japão, nos Estados Unidos e na Europa Ocidental. As lâmpadas de tungstênio-halogênio têm lâmpadas compactas que introduzem uma série de vantagens sobre as lâmpadas incandescentes normais, mais notavelmente sua luz brilhante, menor dimensão, uniformidade de iluminação, maior vida útil da lâmpada e maior economia. Ao contrário das lâmpadas incandescentes de filamento de tungstênio, as lâmpadas de tungstênio-halogênio têm halogênios adicionados ao vidro de enchimento. Os halogênios (geralmente iodo) garantem que todo o tungstênio vaporizado seja devolvido ao filamento e não depositado sobre o envelope de vidro.
CUIDADO!
As lâmpadas de tungstênio-halogênio operam a temperaturas muito altas e podem causar ferimentos graves por queimaduras se manuseadas a quente. Ao substituir essas lâmpadas, sempre deixe esfriar por pelo menos 20 minutos antes de retirá-las do abajur. Evite entregar o envelope da lâmpada diretamente porque as impressões digitais deixadas no envelope ficarão queimadas no vidro, muitas vezes iniciando a falha prematura da lâmpada. Os fabricantes embalam lâmpadas de tungstênio-halogênio em sacos plásticos protetores para evitar problemas de manuseio. Use uma tesoura para cortar o saco perto dos pinos de tungstênio e insira a lâmpada em seu suporte enquanto ele ainda permanece no saco. Retire o saco quando a lâmpada estiver posicionada corretamente no candeeiro.
Os filamentos das lâmpadas de tungstênio-halogênio são muitas vezes matrizes muito compactas montadas em um envelope de vidro de haleto de borossilicato (muitas vezes denominado "quartzo fundido"). As tensões de operação para essas lâmpadas variam de 4-24 volts com potências de 20-100 watts. Eles têm temperaturas de operação de filamento muito altas, restringindo seu uso a lâmpadas bem ventiladas com dissipadores de calor em forma de ventilador para eliminar a enorme quantidade de calor gerado por essas lâmpadas. A base é um estilo de dois pinos com fios de chumbo de tungstênio fundidos ao envelope de vidro borossilicato. A iluminação das lâmpadas de tungstênio-halogênio é notavelmente uniforme durante toda a vida útil da lâmpada, que pode variar de 1000-2500 horas. As lâmpadas de tungstênio-halogênio emitem um espectro contínuo de luz com uma temperatura de cor que varia de 2700-3350 K (dependendo da tensão), embora haja algum declínio no valor da temperatura de cor à medida que as lâmpadas começam a envelhecer.
A lâmpada ilustrada na Figura 3(f) é um refletor dicroico de tungstênio-halogênio que é comumente usado em fontes de luz de fibra óptica, como a retratada acima na Figura 4. O refletor ajuda a direcionar a luz, permitindo que a maior parte da radiação infravermelha gerada por essas lâmpadas passe através da carcaça do refletor do espelho dicroico, enquanto reflete os comprimentos de onda visíveis e ultravioletas mais curtos. Estas lâmpadas operam a 6 a 21 volts DC e geralmente são colocadas em um abajur que proporciona o controle da tensão de operação, bem como a remoção do excesso de calor através de ventiladores de resfriamento. Os iluminadores que usam essas lâmpadas são muitas vezes denominados "halogênios de quartzo" lâmpadas de fibra óptica que fornecem iluminação de alta intensidade, mas têm a desvantagem de produzir uma quantidade significativa de luz infravermelha na forma de calor. A iluminação direta em um espécime geralmente resultará em um alto grau de absorção de calor pelo espécime, e deve-se tomar cuidado para garantir que isso não leve à degradação. O abajur ilustrado na Figura 4 contém elementos de lente nas extremidades dos tubos de fibra óptica que permitem que a luz seja focalizada no espécime.
Também estão disponíveis outros componentes periféricos, como filtros de vidro colorido para produzir efeitos especiais de iluminação e polarizadores que se fixam aos elementos da lente para permitir a iluminação com luz polarizada. Essas fontes de luz são frequentemente usadas como
iluminação oblíqua auxiliar para microscopia de luz refletida com microscópios compostos e estéreo. Iluminadores de anel especialmente projetados, como ilustrado na Figura 5, podem ser usados para criar uma iluminação branca brilhante de 360° e sem sombra e de intensidade uniforme. Eles são projetados para montar diretamente em objetivas de microscópio estéreo e são úteis mesmo com objetivas de alta ampliação e longa distância de trabalho (1,5 a 10 polegadas) sem ajuste de luz ao refocar ou quando recursos de zoom são usados. As unidades polarizadoras são fabricadas para as guias de luz anelar para que a luz refletida de volta para a objetiva possa ser polarizada. Há também kits de filtro de vidro e gelatina que podem ser usados com esses acessórios de iluminação.
Os microscópios não equipados com uma fonte interna de iluminação devem recorrer a fontes luminosas externas para fornecer iluminação à amostra. Uma fonte de iluminação externa típica é ilustrada na Figura 6. Esses iluminadores podem conter uma variedade de lâmpadas incandescentes de tungstênio, incluindo lâmpadas DC de 6-12 volts, bem como lâmpadas de filamento de bobina de 120 volts que ostentam classificações de potência de 25-100 watts.
As versões alimentadas por corrente contínua da fonte de iluminação externa mostrada na Figura 6 geralmente têm uma fonte de alimentação externa que converte a energia de parede de 120 volts nos 6-12 volts DC necessários exigidos pela lâmpada. Essas fontes também são geralmente equipadas com difusores para uniformizar a intensidade da luz, bem como filtros para ajudar no equilíbrio de cores. Alguns modelos também fornecem espaço para um polarizador para que a microscopia de luz polarizada possa ser realizada com a lâmpada externa. As lâmpadas geralmente têm um diafragma de "campo" que permite ao microscopista ajustar o diâmetro do feixe de luz que entra no microscópio. As fontes de luz externas focalizam a luz em um espelho de subestágio que deve ser cuidadosamente ajustado para refletir a luz no condensador no ângulo adequado para permitir que a luz que entra na objetiva seja "centralizada" dentro do eixo óptico do microscópio.
Diafragma de Campo - Tutorial Java
O diafragma de campo controla a quantidade de luz que entra no condensador de subestágio e, consequentemente, no restante do microscópio. Instruções sobre como usar este tutorial aparecem abaixo da janela.
Para operar o tutorial, use o cursor do mouse para arrastar o controle deslizante para abrir e fechar o diafragma de campo. A imagem de um carrapato de veado no campo de visão reagirá às configurações do diafragma. À medida que o diafragma é fechado, a imagem desfocada do diafragma se fecha no carrapato do veado no campo de visão. Quando completamente fechado, o diafragma não permite que nenhuma luz entre no microscópio.
Lâmpadas de arco - Lâmpadas de arco de vapor de mercúrio, xenônio e zircônio também são fontes úteis de iluminação para formas especializadas de microscopia. Essas lâmpadas são controladas por fontes de alimentação externas que são projetadas para atender aos requisitos elétricos de primeiro acender a lâmpada e, em seguida, fornecer a corrente
correta para manter a iluminação constante. Vários projetos típicos de lâmpadas de arco são ilustrados na Figura 7. A lâmpada na Figura 7(a) é uma lâmpada de vapor de mercúrio equipada com um eletrodo de ignição e a lâmpada na Figura 7(b) é uma moderna lâmpada HBO de 200 watts de arco curto de mercúrio alimentada com corrente alternada através de uma fonte de alimentação externa. Esta e outras fontes de alimentação de lâmpada de arco semelhantes fornecerão energia de partida suficiente para inflamar o queimador (por ionização do vapor gasoso) e mantê-lo queimando com um mínimo de cintilação.
As lâmpadas de arco têm uma vida útil média de cerca de 200 horas e a maioria das fontes de alimentação externas são equipadas com um temporizador que permite ao microscopista monitorar quanto tempo decorreu. As lâmpadas de arco de mercúrio (muitas vezes referidas como "queimadores") variam em potência de 50 watts a 200 watts e
consistem geralmente de dois eletrodos selados sob alta pressão em um envelope de vidro de quartzo que também contém mercúrio. Estas lâmpadas de arco não fornecem intensidade uniforme em todo o espectro, do ultravioleta próximo ao infravermelho (ver Figura 8 para o espectro de emissão da lâmpada de arco de mercúrio).
Grande parte da intensidade da lâmpada de arco de mercúrio é gasta no ultravioleta próximo, com picos de intensidade em 313, 334, 365, 406, 435, 546 e 578 nanômetros. Estas lâmpadas não são geralmente úteis para a maioria das formas de microscopia (com exceção da microscopia de fluorescência), mas servem como excelentes fontes de luz monocromática para
fotomicrografia em preto e branco. Usando os filtros apropriados, a linha verde em 546 nanômetros, a linha azul em 435 nanômetros e a linha ultravioleta próxima em 365 ou 406 nanômetros podem produzir excelente luz monocromática em regiões de comprimento de onda selecionadas. Uma lâmpada de arco de vapor de mercúrio nunca deve ser usada para fotomicrografia de campo claro, campo escuro, CID ou cor polarizada, porque o espectro de emissão limitado das lâmpadas não produzirá representações de cores verdadeiras do espécime.
As lâmpadas de arco de xenônio têm intensidade muito mais uniforme em todo o espectro visível do que as lâmpadas de vapor de mercúrio (ver Figura 9); Eles não têm os picos de intensidade espectral muito altos que são característicos das lâmpadas de mercúrio. As lâmpadas de xenônio são deficientes no ultravioleta; Eles gastam uma grande proporção de sua intensidade no infravermelho e, portanto, o uso de tais lâmpadas requer cuidados no controle do calor. Queimadores de xenônio de curta distância são geralmente mais desejáveis porque o tamanho do arco é tal que sua luz pode ser muito mais facilmente incluída dentro da abertura traseira da objetiva, evitando assim o desperdício de intensidade de luz.
CUIDADO!
As lâmpadas de arco de mercúrio e xenônio requerem cautela durante a operação devido ao perigo de explosão devido a pressões internas de gás muito altas e calor extremo gerado durante o uso. Nunca acenda uma lâmpada fora de sua caixa ou observe a lâmpada diretamente quando ela estiver queimando (isso pode causar sérios danos aos olhos). Nem as lâmpadas de mercúrio nem de xenônio devem ser manuseadas com os dedos nus, a fim de evitar a corrosão inadvertida do envelope de quartzo. Troque as lâmpadas somente depois que a lâmpada tiver tido tempo suficiente para esfriar. Guarde lâmpadas em seus contêineres para evitar acidentes.
Sempre siga os procedimentos de segurança listados acima ao instalar ou trocar lâmpadas de arco de mercúrio ou xenônio. As lâmpadas de arco de mercúrio, como descrito acima, têm uma vida útil de cerca de 200 horas; queimadores de xenônio várias centenas de horas. A comutação liga/desliga frequente reduz a vida útil da lâmpada. Quando os queimadores atingem sua vida útil nominal, as emissões espectrais podem mudar e o envelope de quartzo enfraquece.
As lâmpadas de arco de zircônio são outra excelente fonte de iluminação para microscópios. Eles fornecem um feixe de luz muito pequeno (quase uma fonte pontual) que tem uma temperatura de cor de cerca de 3200 K. Embora essas lâmpadas não emitam luz tão brilhante quanto as lâmpadas de arco de mercúrio ou xenônio, elas fornecem um espectro contínuo de luz que é adequado para fotomicrografia usando filme colorido.
Fontes de Luz Laser - Nos últimos anos, tem havido um uso crescente de lasers, particularmente o laser de íons de argônio com poderosa capacidade de emissão em 488 e 514 nanômetros. As fontes de laser, apesar do alto custo, tornaram-se especialmente úteis na microscopia confocal de varredura a laser.
Lasers - Java Tutorial
Este tutorial simula a descarga de um laser de rubi com um tubo de flash de xenônio. Os átomos de cromo no cristal do laser são excitados por um tubo de flash (não mostrado) e emitem fótons que são refletidos para frente e para trás entre dois espelhos nas extremidades do cristal do laser.
À medida que os fótons atravessam o cristal, eles estimulam a emissão de fótons adicionais até que energia suficiente esteja disponível para que um pulso de fótons rompa a extremidade finamente espelhada à direita do cristal laser.
Existem vários tipos diferentes de lasers que fornecem um espectro de emissão único. A Figura 10 ilustra os espectros de emissão dos dois lasers mais utilizados em microscopia (fluorescência, campo claro confocal e monocromático).
Flash eletrônico - Um método especializado para fotografar espécimes em movimento (especialmente em iluminação de campo escuro) foi desenvolvido usando sistemas de flash de fotografia eletrônica. Estes tubos flash fornecem iluminação de 5500 K em uma explosão instantânea que pode capturar grandes detalhes do espécime quando usados com filme de transparência de luz do dia de alta velocidade (ISO 400 e acima). Essas unidades devem ser acompanhadas por uma fonte contínua de iluminação de tungstênio para garantir o enquadramento da amostra, a iluminação de Köhler, a focalização e o alinhamento do microscópio antes da fotomicrografia flash. Os tubos de flash devem ser sincronizados com o obturador da câmera do microscópio, e vários fabricantes fornecem este equipamento como um acessório para fotomicrografia.
Fontes de Luz
Autores Contribuintes
Mortimer Abramowitz - Olympus America, Inc., Two Corporate Center Drive., Melville, Nova Iorque, 11747.
Matthew J. Parry-Hill e Michael W. Davidson - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., Universidade Estadual da Flórida, Tallahassee, Flórida, 32310.
