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Iluminação do microscópio

Microscópios sofisticados e bem equipados não conseguem produzir imagens excelentes devido ao uso incorreto da fonte de luz, o que geralmente leva à iluminação inadequada da amostra. Quando otimizada, a iluminação do espécime deve ser brilhante, livre de brilho e uniformemente dispersa no campo de visão.

Existem inúmeras fontes de luz disponíveis para iluminar microscópios, tanto para observação de rotina quanto para fotomicrografia crítica. Uma fonte de luz mais comum, devido ao seu baixo custo e longa vida, é a lâmpada halógena de tungstênio de 50 ou 100 watts, como ilustrado na base do diagrama do microscópio na Figura 1, que também detalha as vias ópticas em um microscópio de luz transmitido moderno típico. Nesta figura, a lâmpada de tungstênio-halogênio emite um espectro contínuo de luz centrado em 3200 K (quando ajustado a uma tensão de lâmpada de +9 volts), que é então passado através de um coletor e lente de campo antes de ser refletido no condensador de subestágio e no espécime. Os raios de luz formadores de imagem são capturados pela objetiva do microscópio e passados para as oculares ou direcionados por um divisor de feixe para uma das várias portas da câmera. Ao longo do caminho óptico do microscópio, a iluminação é direcionada e focalizada através de uma série de diafragmas e lentes à medida que viaja da fonte para iluminar o espécime e, em seguida, para as oculares ou acessório da câmera. O alinhamento dos componentes ópticos de um microscópio para otimizar a iluminação em microscópios modernos é realizado seguindo as regras da iluminação Köhler. Mais detalhes de como os microscópios de luz transmitida e refletida são alinhados para a iluminação adequada da Köhler são discutidos em nossas seções sobre a criação de um microscópio para luz transmitida e luz refletida. As vias ópticas mostradas acima na Figura 1 são típicas de um microscópio de luz transmitida e envolvem um número de lentes, diafragmas, espelhos e divisores de feixe para direcionar a luz através do microscópio.

As lâmpadas de tungstênio-halogênio são relativamente brilhantes com um espectro de cores centrado em 3200 K (quando ajustadas em aproximadamente +9 volts), mas requerem filtros de conversão de cor para aumentar sua temperatura de cor para a equivalência da luz do dia. Outra fonte de luz popular é a lâmpada de xenônio de 75 a 150 watts por causa de seu brilho muito alto e longa vida, uma saída relativamente uniforme em todo o espectro visual e uma temperatura de cor que se aproxima da exigida por emulsões de filme à luz do dia. Quando é necessária uma intensidade luminosa muito elevada, são frequentemente utilizadas lâmpadas de haleto de estanho. Na microscopia de fluorescência, particularmente para fins de fotomicrografia crítica, queimadores de mercúrio de 100 watts ou 200 watts são frequentemente empregados. Em anos anteriores, lâmpadas de arco de carbono ou lâmpadas de zircônio poderiam ter sido usadas, mas essas fontes raramente são vistas hoje. Para obter mais informações e uma discussão detalhada do amplo espectro de lâmpadas disponíveis para iluminação de microscópios, visite nossa seção sobre fontes de luz para microscopia e fotomicrografia.

O alinhamento da iluminação da fonte através de vias ópticas na microscopia de luz refletida também é de preocupação primária, particularmente no que diz respeito à metalografia, inspeção de wafer semicondutor e o notável novo progresso que está sendo feito na microscopia de fluorescência. Microscópios de luz refletida também são iluminados com uma variedade de fontes de luz (como discutido acima) e podem ser ajustados para um desempenho ideal usando a iluminação Köhler. Isso é discutido em maiores detalhes em nossa seção sobre configuração da iluminação Köhler para microscopia de luz refletida. Caminhos de iluminação para microscopia de luz refletida também são o tópico de vários tutoriais interativos de Java, incluindo o que está ligado diretamente abaixo.

Em seu excelente livro "Fotografia Através do Microscópio", João Delly argumenta que entre 80 e 90 por cento de todas as fotomicrografias submetidas a concursos, exposições e publicações científicas são vítimas de óptica mal alinhada, resultando em má iluminação das amostras. Este é um dos problemas mais comuns com microscopia e fotomicrografia em geral, e um exame surpresa dos microscópios estudantis em muitos laboratórios universitários revelará uma abundância de condensadores de subestágio mal ajustados e fontes de iluminação. Suspeitamos que o alinhamento e ajuste incorretos tanto do condensador de subestágio quanto do diafragma de campo, ao longo de toda a gama de objetivas em um determinado microscópio, sejam a maior fonte de erros na fotomicrografia.

A necessidade de iluminação adequada não pode ser exagerada. Muitas vezes, um microscópio de US$ 25.000 é reduzido ao nível de uma lupa de mão por iluminação e alinhamento inadequados, resultando em fotomicrografias que são superadas por aquelas tiradas com um microscópio de US$ 2000.<> sob condições ideais de iluminação Köhler. Nas seções complementares desta cartilha que tratam da teoria da iluminação de Köhler e sua implementação (tanto para luz transmitida quanto refletida), discutimos aspectos críticos da configuração do microscópio e incluímos uma variedade de tutoriais interativos de Java para ajudar os alunos a dominar esses importantes conceitos.

Iluminação Afocal ou Não Focada - Os sistemas de iluminação que não formam uma imagem da fonte de luz em algum ponto da via óptica são chamados de iluminação afocal ou não focada. Antes da invenção das lâmpadas elétricas, os microscopistas eram limitados na escolha de fontes adequadas para a iluminação do microscópio. Durante o dia, eles podiam apontar seus microscópios (ou espelhos refletores de subestágio) para o céu e usar as nuvens como uma tela de difusão bruta para espalhar a iluminação uniformemente por todo o campo de visão. Os fabricantes de instrumentos também aterram espelhos para produzir superfícies refletivas côncavas em um esforço para aumentar a intensidade da luz no plano do objeto. Nuvens e céu azul não são fontes de luz que se prestam a ser facilmente fotografadas dentro da via óptica do microscópio e, portanto, são fontes de iluminação afocal. O trabalho interno e noturno obrigou os primeiros microscopistas a confiar em fontes artificiais de iluminação que, devido à inerente temperatura de cor mais baixa produzida por essas fontes, tornavam as cores dos espécimes em intensidades, matizes e tons diferentes dos observados sob a luz natural do dia. Para compensar isso, os microscopistas usaram vários tipos de filtros azuis para alterar a temperatura de cor aparente da luz artificial para coincidir com a da luz natural. No entanto, sem formar uma imagem da fonte de luz em algum lugar dentro do caminho óptico, esses vários métodos iniciais de iluminação ainda se enquadram na categoria de iluminação afocal ou não focada.

As primeiras investigações revelaram que, ao girar entre a luz do dia e as fontes de luz artificial, não há (na prática) mudanças evidentes no caráter óptico ou no poder de resolução da imagem, desde que a lente traseira da objetiva esteja completamente cheia de luz. Mais tarde, os cientistas descobriram que o requisito mais importante é que a abertura numérica da iluminação seja pelo menos igual à do objetivo. No século XIX, novas fontes de iluminação foram desenvolvidas, e um novo método de "foco na fonte" (mais tarde denominado iluminação crítica ou nelsoniana) foi desenvolvido para melhorar as condições de iluminação do microscópio.

Iluminação crítica (ou nelsoniana) - Este método de iluminação de microscópio foi desenvolvido pela primeira vez pelo microscopista britânico Edward Nelson usando princípios ópticos avançados por Ernst Abbe. A iluminação nelsoniana foi usada com muito sucesso por microscopistas a partir do final do século XIX até bem no século XX. Hoje, ainda há alguns defensores da iluminação crítica que continuam a usá-la com microscópios que exigem fontes de luz externas, ou com microscópios estudantis mais baratos, onde a fotomicrografia não é um problema.

A iluminação nelsoniana depende do uso do condensador de subestágio para produzir uma imagem focalizada da chama a partir de uma lâmpada de óleo em chamas (ou outra fonte de luz homogênea) no plano do espécime para alcançar uma condição de iluminação um pouco uniforme em todo o campo de visão. A homogeneidade da fonte de luz é o aspecto importante quando se considera este método de iluminação. A chama produzida por uma lâmpada em chamas é bastante uniforme e consistente, mas outras fontes, como lâmpadas foscas, lâmpadas opalas ou filamentos de fita também podem ser usadas para iluminação crítica. A Figura 2 ilustra as vias ópticas de iluminação crítica usando uma lâmpada de óleo hipotética que fornece uma fonte de iluminação homogênea.

A luz emitida pela chama da lâmpada de óleo deve ser focalizada pelo condensador de subestágio (ver figura 2) de modo a que seja produzida uma imagem da chama no plano da amostra na microlâmina. Na prática, muitas vezes é difícil (ou impossível) encontrar foco na porção central da chama, de modo que a "borda" da chama geralmente é focada com posterior reajuste do espelho do subestágio para que a imagem da porção central da chama preencha o campo de visão. A quantidade de luz que entra no microscópio pode ser controlada pelo diafragma de campo, que (se presente) é geralmente ligado externamente. Luz suficiente deve entrar no microscópio para preencher completamente o plano posterior da objetiva, e isso pode ser controlado através do ajuste adequado do diafragma da abertura do condensador. Focalizar a fonte de luz no plano da amostra é precário e muitas vezes pode produzir um fundo granulado, irregular ou pontilhado. Isso pode ser superado desfocando ligeiramente o condensador de subestágio para produzir um fundo mais uniforme. A iluminação nelsoniana foi amplamente suplantada pelo método Köhler muito mais eficiente de iluminação ao microscópio.

Iluminação Köhler - Este tópico será discutido com mais detalhes em outra seção da cartilha, mas abordaremos brevemente os principais aspectos aqui. Na iluminação de Köhler, uma imagem da fonte de luz é focalizada no diafragma da abertura do condensador para produzir luz paralela (e sem foco) através do plano do espécime ou objeto. Uma imagem ampliada da fonte de luz abaixo do condensador (no diafragma da abertura) produz um amplo cone de iluminação que é necessário para a resolução ideal do espécime. O tamanho do diafragma de abertura do condensador pode ser usado para controlar a abertura numérica do cone de luz que ilumina a amostra e reduzir a luz e o brilho indesejados. Além disso, a imagem de poeira e outras imperfeições nas superfícies de vidro do condensador é minimizada.

A iluminação eficiente da amostra depende muito do alinhamento adequado de todos os componentes ópticos no microscópio, incluindo a fonte de iluminação. O microscopista sério deve se familiarizar com a faixa de ajuste de cada componente e deve praticar alinhá-los com diferentes amostras e objetivos. A iluminação irregular pode ter um sério impacto na qualidade das fotomicrografias, causando "pontos quentes", vinhetas, franjas coloridas, contraste fraco e uma variedade de outros efeitos indesejáveis. Alguns dos microscópios mais recentes são equipados com lâmpadas "pré-centradas" que não permitem o ajuste, e alguns até fornecem condensadores que não possuem mecanismos de ajuste lateral. É importante garantir que esses microscópios foram alinhados para a iluminação adequada da Köhler na fábrica antes de se envolverem na fotomicrografia. Leia atentamente o manual de instruções do microscópio e/ou questione seu representante técnico de fábrica para obter detalhes importantes sobre como esses microscópios são otimizados para iluminação.