O conceito de ampliação

Um microscópio simples ou lupa (lente) produz uma imagem do objeto sobre o qual o microscópio ou lupa é focado. As lentes de lupa simples são biconvexas, o que significa que são mais espessas no centro do que na periferia, como ilustrado com a lupa na Figura 1. A imagem é percebida pelo olho como se estivesse a uma distância de 10 polegadas ou 25 centímetros (a referência, ou distância de visualização tradicional ou convencional).

Como a imagem parece estar no mesmo lado da lente que o objeto, ela não pode ser projetada em uma tela. Tais imagens são denominadas imagens virtuais e aparecem eretas, não invertidas. A Figura 1 apresenta uma ilustração de como uma lente de aumento simples opera. O objeto (neste caso, o sujeito é uma rosa) está sendo visto com uma lente biconvexa simples. A luz refletida da rosa entra na lente em linhas retas, como ilustrado na Figura 1. Essa luz é refratada e focalizada pela lente para produzir uma imagem virtual na retina. A imagem da rosa é ampliada porque percebemos que o tamanho real do objeto (a rosa) está no infinito porque nossos olhos traçam os raios de luz de volta em linhas retas para a imagem virtual (Figura 1).

Quando você olha para um microscópio, você não está olhando para o espécime, você está olhando para a imagem do espécime. A imagem parece estar "flutuando" no espaço cerca de 10 milímetros abaixo do topo do tubo de observação (no nível do diafragma fixo da ocular) onde a ocular está inserida. A imagem que você observa não é tangível; não pode ser apreendido. É um "mapa" ou representação do espécime em várias cores e/ou tons de cinza do preto ao branco. A expectativa é que a imagem seja uma representação precisa do espécime; preciso quanto aos detalhes, forma e cor/intensidade. As implicações são que pode muito bem ser possível (e é) produzir imagens altamente precisas. Por outro lado, pode ser (e muitas vezes é) muito fácil degradar uma imagem através de técnica inadequada ou equipamento deficiente.

Para entender como as lentes do microscópio funcionam, você deve lembrar alguns dos princípios básicos da ação da lente na formação da imagem. Agora analisaremos vários cenários de imagem diferentes usando uma lente biconvexa simples:

A luz de um objeto que está muito longe da frente de uma lente convexa (vamos supor que nosso "objeto" é a girafa ilustrada na Figura 2) será levada a um foco em um ponto fixo atrás da lente. Isso é conhecido como o ponto focal da lente. Todos nós estamos familiarizados com a ideia de um "vidro queimando" que pode focar os raios essencialmente paralelos do sol para queimar um buraco em pedaço de papel. O plano vertical em que se encontra o ponto focal é o plano focal.

A distância do centro da lente convexa ao plano focal é conhecida como distância focal. (Para uma lente convexa fina simétrica idealizada, essa distância é a mesma na frente ou atrás da lente.) A imagem de nossa girafa agora aparece no plano focal (como ilustrado na Figura 2). A imagem é menor que o objeto (a girafa); é invertida e é uma imagem real capaz de ser capturada em filme. É o caso da câmera usada para fotografia cênica comum.

O objeto agora é movido para mais perto da frente da lente, mas ainda tem mais de duas distâncias focais na frente da lente (esse cenário é abordado na Figura 3). Agora, a imagem é encontrada mais atrás da lente. É maior do que o descrito acima, mas ainda é menor do que o objeto. A imagem é invertida, e é uma imagem real. Este é o caso da fotografia de retrato comum.

O objeto é levado ao dobro da distância focal na frente da lente. A imagem agora está a duas distâncias focais atrás da lente, como ilustrado na Figura 4. É do mesmo tamanho que o objeto; é real e invertido.

O objeto agora está situado entre uma e duas distâncias focais na frente da lente (mostrado na Figura 5). Agora, a imagem está ainda mais longe da parte de trás da lente. Desta vez, a imagem é ampliada e é maior que o objeto; ainda está invertida e é real. Este caso descreve o funcionamento de todas as objetivas de comprimento de tubo finito usadas em microscopia. Tais objetivas de comprimento finito do tubo projetam uma imagem real, invertida e ampliada no tubo do corpo do microscópio. Esta imagem entra em foco no plano do diafragma fixo na ocular. A distância do plano focal posterior da objetiva (não necessariamente sua lente posterior) ao plano do diafragma fixo da ocular é conhecida como o comprimento do tubo óptico da objetiva.

No último caso, o objeto está situado no plano focal frontal da lente convexa. Neste caso, os raios de luz emergem da lente em paralelo. A imagem está localizada no mesmo lado da lente que o objeto e aparece na vertical (veja a Figura 1). A imagem é virtual e aparece como se estivesse a 10 centímetros do olho, semelhante ao funcionamento de uma simples lupa; O fator de ampliação depende da curvatura do cristalino.

O último caso listado acima descreve o funcionamento da ocular de observação do microscópio. O "objeto" examinado pela ocular é a imagem ampliada, invertida, real projetada pela objetiva. Quando o olho humano é colocado acima da ocular, a lente e a córnea do olho "olham" para essa imagem virtual secundariamente ampliada e veem essa imagem virtual como se estivesse a 10 centímetros do olho, perto da base do microscópio.

Este caso também descreve o funcionamento dos objetivos corrigidos infinitamente agora amplamente utilizados. Para tais objetivos, o objeto ou espécime é posicionado exatamente no plano focal frontal da objetiva. A luz de tal lente emerge em raios paralelos de cada azimute. Para focalizar tais raios, o corpo do microscópio ou a cabeça de observação binocular deve incorporar uma lente tubular no caminho da luz, entre a objetiva e a ocular, projetada para trazer a imagem formada pela objetiva para focalizar no plano do diafragma fixo da ocular. A ampliação de uma objetiva corrigida infinitamente é igual à distância focal da lente de tubo (para Olimpo equipamento este é de 180mm, Nikon usa uma distância focal de 200mm; outros fabricantes usam outras distâncias focais) divididas pela distância focal da lente objetiva em uso. Por exemplo, uma objetiva de 10X corrigida para o infinito, na série Olympus, teria uma distância focal de 18mm (180mm/10).

Uma maneira fácil de entender o microscópio é por meio de uma comparação com um projetor de slides, um dispositivo familiar para a maioria de nós. Visualize um projetor de slides ligado em sua extremidade com a caixa da lâmpada apoiada em uma mesa. A luz da lâmpada passa através de uma lente de condensação, e depois através da transparência, e então através da lente de projeção em uma tela colocada em ângulos retos para o feixe de luz a uma determinada distância da lente de projeção. A imagem real nesta tela emerge invertida (de cabeça para baixo e invertida) e ampliada. Se tirássemos a tela e, em vez disso, usássemos uma lupa para examinar a imagem real no espaço, poderíamos ampliar ainda mais a imagem, produzindo assim outra ampliação ou de segundo estágio.

Agora vamos descrever como um microscópio funciona com um pouco mais de detalhes. A primeira lente de um microscópio é a mais próxima do objeto a ser examinado e, por isso, é chamada de objetiva. A luz de uma fonte externa ou interna (dentro do corpo do microscópio) é primeiramente passada através do condensador de subestágio, que forma um cone de luz bem definido que se concentra no objeto (amostra). A luz passa através do espécime e para a objetiva (semelhante à lente de projeção do projetor descrita acima), que então projeta uma imagem real, invertida e ampliada do espécime para um plano fixo dentro do microscópio que é denominado plano intermediário da imagem (ilustrado na Figura 6). O objetivo tem várias funções principais:

• O objetivo deve recolher a luz proveniente de cada uma das várias partes ou pontos do espécime.

• O objetivo deve ter a capacidade de reconstituir a luz vinda dos vários pontos do espécime nos vários pontos correspondentes na imagem (às vezes chamados de antipontos).

• O objetivo deve ser construído de modo que ele seja focado perto o suficiente do espécime para que ele projete uma imagem ampliada e real no tubo corporal.

O plano intermediário da imagem geralmente está localizado cerca de 10 milímetros abaixo do topo do tubo do corpo do microscópio em um local específico dentro do diafragma interno fixo da ocular. A distância entre o plano focal posterior da objetiva e a imagem intermediária é denominada comprimento do tubo óptico. Note que esse valor é diferente do comprimento do tubo mecânico de um microscópio, que é a distância entre a peça nasal (onde a objetiva é montada) até a borda superior dos tubos de observação onde as oculares (oculares) são inseridas.

A ocular ou ocular, que se encaixa no tubo do corpo na extremidade superior, é o componente óptico mais distante do espécime. Nos microscópios modernos, a ocular é mantida no lugar por um ombro na parte superior do tubo de observação do microscópio, o que a impede de cair no tubo. O posicionamento da ocular é tal que sua lente ocular (superior) amplia ainda mais a imagem real projetada pela objetiva. O olho do observador vê essa imagem secundariamente ampliada como se estivesse a uma distância de 10 polegadas (25 centímetros) do olho; portanto, essa imagem virtual aparece como se estivesse perto da base do microscópio. A distância do topo do tubo de observação do microscópio até o ombro da objetiva (onde ele se encaixa na peça nasal) é geralmente de 160 mm em um sistema de comprimento de tubo finito. Isso é conhecido como o comprimento do tubo mecânico, como discutido acima. A ocular tem várias funções principais:

• A ocular serve para ampliar ainda mais a imagem real projetada pelo objetivo.

• Na observação visual, a ocular produz uma imagem virtual secundariamente ampliada.

• Na fotomicrografia, produz uma imagem real secundariamente ampliada projetada pelo objetivo. Esta imagem real aumentada pode ser projetada no filme fotográfico em uma câmera ou em uma tela mantida acima da ocular.

• A ocular pode ser ajustada com escamas, marcadores ou miras (muitas vezes referidas como gratículas, retículas ou retículos) de tal forma que a imagem dessas inserções pode ser sobreposta à imagem do espécime.

O fator que determina a quantidade de ampliação da imagem é o poder de ampliação objetivo, que é predeterminado durante a construção dos elementos ópticos objetivos. Os objetivos normalmente têm poderes de ampliação que variam de 1:1 (1X) a 100:1 (100X), com os poderes mais comuns sendo 4X (ou 5X), 10X, 20X, 40X (ou 50X) e 100X. Uma característica importante das objetivas do microscópio são suas distâncias focais muito curtas que permitem maior magnificação a uma dada distância quando comparadas a uma lente de mão comum (ilustrada na Figura 1). A principal razão pela qual os microscópios são tão eficientes na ampliação é o aumento de dois estágios que é alcançado em um caminho óptico tão curto, devido às curtas distâncias focais dos componentes ópticos.

As oculares, assim como as objetivas, são classificadas em termos de sua capacidade de ampliar a imagem intermediária. Seus fatores de ampliação variam entre 5X e 30X, com as oculares mais comumente usadas tendo um valor de 10X-15X. A ampliação visual total do microscópio é obtida multiplicando-se os valores de ampliação da objetiva e da ocular. Por exemplo, usar uma objetiva de 5X com uma ocular de 10X produz uma ampliação visual total de 50X e, da mesma forma, na extremidade superior da escala, usar uma objetiva de 100X com uma ocular de 30X dá uma ampliação visual de 3000X.

A ampliação total também depende do comprimento do tubo do microscópio. A maioria dos microscópios de comprimento de tubo fixo padrão tem um comprimento de tubo de 160, 170, 200 ou 210 milímetros, sendo 160 milímetros o mais comum para microscópios biomédicos de luz transmitida. Muitos microscópios industriais, projetados para uso na indústria de semicondutores, têm um comprimento de tubo de 210 milímetros. As objetivas e oculares desses microscópios têm propriedades ópticas projetadas para um comprimento de tubo específico, e o uso de uma objetiva ou ocular em um microscópio de diferentes comprimentos de tubo levará a mudanças no fator de magnificação (e também pode levar a um aumento nos erros de lente de aberração óptica). Microscópios com correção infinita também possuem oculares e objetivas que são opticamente sintonizadas com o design do microscópio, e estas não devem ser trocadas entre microscópios com diferentes comprimentos de tubo infinito.

Microscópios de pesquisa modernos são muito complexos e muitas vezes têm iluminadores episcópicos e diascópicos embutidos na caixa do microscópio. As constrições de design nesses microscópios impedem limitar o comprimento do tubo à dimensão física de 160 milímetros, resultando na necessidade de compensar o tamanho físico adicional do corpo do microscópio e do tubo mecânico. Isso é feito pela adição de um conjunto de lentes paralelizantes para encurtar o comprimento aparente do tubo mecânico do microscópio.

Essas lentes adicionais às vezes introduzem um fator de ampliação adicional (geralmente em torno de 1,25-1,5X) que deve ser levado em conta ao calcular a ampliação visual e fotomicrográfica. Este fator de ampliação adicional é referido como um fator de tubo nos manuais de usuário fornecidos pela maioria dos fabricantes de microscópios. Assim, se uma objetiva de 5X está sendo usada com um conjunto de oculares de 15X, então a ampliação visual total se torna 93,75X (usando um fator de tubo de 1,25X) ou 112,5X (usando um fator de tubo de 1,5X).

Além das lentes de paralelização usadas em alguns microscópios, os fabricantes também podem fornecer lentes adicionais (às vezes chamadas de trocadores de ampliação) que podem ser giradas na via óptica para aumentar o fator de ampliação. Isso geralmente é feito para facilitar o enquadramento de espécimes para fotomicrografia. Essas lentes geralmente têm fatores de ampliação muito pequenos, variando de 1,25X até 2,5X, mas o uso dessas lentes pode levar a uma ampliação vazia, uma situação em que a imagem é ampliada, mas nenhum detalhe adicional é resolvido. Esse tipo de erro é ilustrado na Figura 7 com fotomicrografias do DNA cristalino líquido. A fotomicrografia da Figura 7(a) foi realizada com objetiva acromática plana de 20X sob luz polarizada com abertura numérica de 0,40 e ampliada fotograficamente por um fator de 10X. O detalhe é nítido e o foco é nítido nesta fotomicrografia que revela muitos detalhes estruturais sobre este polímero líquido cristalino hexagonalmente embalado. Por outro lado, a fotomicrografia à direita (Figura 7(b)) foi realizada com objetiva acromática plana 4X, com abertura numérica de 0,10 e ampliada fotograficamente por um fator de 50X. Esta fotomicrografia carece do detalhe e da clareza presentes na Figura 7(a) e demonstra uma significativa falta de resolução causada pelo fator de ampliação vazio introduzido pelo enorme grau de ampliação.

Deve-se ter cuidado na escolha de combinações oculares/objetivas para garantir a ampliação ideal dos detalhes do espécime sem adicionar artefatos desnecessários. Por exemplo, para conseguir uma ampliação de 250X, o microscopista poderia escolher uma ocular de 25X acoplada a uma objetiva de 10X. Uma opção alternativa para a mesma ampliação seria uma ocular de 10X com objetiva de 25X. Como a objetiva de 25X tem uma abertura numérica maior (aproximadamente 0,65) do que a objetiva de 10X (aproximadamente 0,25), e considerando que os valores de abertura numérica definem a resolução de uma objetiva, fica claro que esta última escolha seria a melhor. Se fossem feitas fotomicrografias do mesmo campo de visão com cada combinação objetiva/ocular descrita acima, seria óbvio que a dupla ocular 10x/objetiva 25x produziria fotomicrografias que se destacariam no detalhe e clareza do espécime quando comparadas à combinação alternativa.

A faixa de ampliação total útil para uma combinação objetiva/ocular é definida pela abertura numérica do sistema. Há uma ampliação mínima necessária para que o detalhe presente em uma imagem seja resolvido, e esse valor geralmente é definido arbitrariamente como 500 vezes a abertura numérica (500 × NA). No outro extremo do espectro, a ampliação útil máxima de uma imagem é geralmente definida em 1000 vezes a abertura numérica (1000 × NA). Ampliações superiores a esse valor não produzirão mais informações úteis ou resolução mais fina dos detalhes da imagem, e geralmente levarão à degradação da imagem, como discutido acima. Exceder o limite de ampliação útil faz com que a imagem sofra com o fenômeno de ampliação vazia (ver Figuras 7 (a) e (b)), onde o aumento da ampliação através da ocular ou lente de tubo intermediário apenas faz com que a imagem se torne mais ampliada sem aumento correspondente na resolução de detalhes.

Estes princípios básicos fundamentam o funcionamento e a construção do microscópio composto que, ao contrário de uma lupa ou microscópio simples, emprega um grupo de lentes alinhadas em série. A elaboração desses princípios levou ao desenvolvimento, ao longo das últimas centenas de anos, dos instrumentos sofisticados de hoje. Microscópios modernos são muitas vezes modulares com peças intercambiáveis para diferentes propósitos; Tais microscópios são capazes de produzir imagens de baixa a alta magnificação com notável clareza e contraste.

Autores Contribuintes

Mortimer Abramowitz - Olympus America, Inc., Two Corporate Center Drive., Melville, Nova Iorque, 11747.

Michael W. Davidson - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., Universidade do Estado da Flórida, Tallahassee, Flórida, 32310.