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iluminação de Köhler

Esta técnica é recomendada por todos os fabricantes de microscópios de laboratório modernos porque pode produzir iluminação de amostra que é uniformemente brilhante e livre de ofuscamento, permitindo assim que o usuário perceba todo o potencial do microscópio.

Os fabricantes projetaram microscópios modernos para que a lente do coletor e quaisquer outros componentes ópticos embutidos na base do microscópio projetem uma imagem ampliada e focada do filamento da lâmpada no plano do diafragma de abertura de um condensador de subestágio adequadamente posicionado. Fechar ou abrir o diafragma do condensador controla o ângulo dos raios de luz que saem do condensador e atingem a amostra de todos os azimutes. Como a fonte de luz não é focalizada no nível do espécime, a luz no nível do espécime é essencialmente sem grãos e estendida e não sofre deterioração de poeira e imperfeições nas superfícies de vidro do condensador. A abertura e o fechamento do diafragma da abertura do condensador controlam o ângulo do cone de luz que atinge o corpo de prova. O ajuste do diafragma de abertura do condensador, juntamente com a abertura da objetiva, determina a abertura numérica realizada do "sistema" do microscópio. À medida que o diafragma do condensador é aberto, a abertura numérica de trabalho do microscópio aumenta, resultando em maior poder de resolução e transmitância da luz. Os raios de luz paralelos que atravessam e iluminam o espécime são focalizados no plano focal posterior da objetiva, onde a imagem do diafragma variável da abertura do condensador e a imagem da fonte de luz serão vistas em foco.

Diafragma de Abertura do Condensador

Abertura Numérica do Condensador de Subestágio - Java Tutorial

Este tutorial explora como o diafragma do condensador de subestágio controla a abertura numérica do cone de luz que ilumina a objetiva.

Para operar o tutorial, basta mover o controle deslizante para cima ou para baixo para alterar a abertura numérica (isso se move em um conjunto pré-determinado de etapas). Observe que mudanças no tamanho do diafragma da abertura do condensador resultam na modificação do tamanho e do ângulo do cone de luz iluminador. Isso controla a abertura numérica do microscópio e regula a quantidade de luz que entra na lente frontal objetiva.

Os caminhos de luz ilustrados na Figura 1 são esquematicamente desenhados para representar caminhos separados percorridos pelo espécime que ilumina os raios de luz e os raios de luz formadores de imagem. Esta não é uma representação verdadeira de qualquer segregação real desses caminhos, mas uma representação diagramática apresentada para fins de visualização e discussão. A Figura 1(a) mostra que os caminhos dos raios para iluminar a luz produzem uma imagem focalizada do filamento da lâmpada no plano do diafragma da abertura do condensador do subestágio, no plano focal posterior da objetiva e no ponto ocular (também chamado de disco de Ramsden) da ocular. Essas áreas que estão em foco comum são frequentemente referidas como planos conjugados, que são críticos para alcançar a iluminação adequada de Köhler. Por definição, um objeto que está em foco em um plano também está em foco nos outros planos conjugados desse caminho de luz. Em cada caminho de luz (formação de imagem e iluminação), existem quatro planos separados que, juntos, compõem o conjunto de planos conjugados.

Os planos conjugados no caminho dos raios luminosos iluminados na iluminação de Köhler [Figura 1(a)] incluem:

O filamento da lâmpada.
O diafragma de abertura do condensador (no plano focal frontal do condensador).
O plano focal posterior do objetivo.
O ponto ocular (também chamado de disco de Ramsden) da ocular, que está localizado aproximadamente meia polegada (um centímetro) acima da lente superior da ocular, no ponto em que o observador coloca a frente do olho durante a observação.

Da mesma forma, os planos conjugados no caminho da luz formadora de imagem na iluminação de Köhler (Figura 1(b)) incluem:

O diafragma de campo.
O espécime focalizado.
O plano intermediário da imagem (ou seja, o plano do diafragma fixo da ocular).
A retina do olho ou o plano de filme da câmera.

Planos focais conjugados são frequentemente úteis na solução de problemas de um microscópio para contaminar poeira, fibras e imperfeições nos elementos ópticos. Se esses artefatos estiverem em foco nítido, segue-se que eles devem residir em ou perto de uma superfície que faz parte do conjunto de planos conjugados formadores de imagens. Os membros deste conjunto incluem o elemento de vidro na porta de luz do microscópio, o espécime, o retículo na ocular e o elemento de lente inferior da ocular. Alternativamente, se esses contaminantes estiverem difusos e fora de foco, procure-os perto do conjunto iluminador de elementos que compartilham planos conjugados. Os suspeitos nesta categoria são a lente superior condensadora (onde poeira e sujeira geralmente se acumulam), o elemento da lente ocular exposta (contaminantes dos cílios) e a lente frontal objetiva (geralmente manchas de impressões digitais).

Planos Conjugados

Planos Conjugados - Java Tutorial

Este tutorial explora como os planos conjugados estão em foco comum quando um microscópio de comprimento de tubo finito é ajustado para a iluminação adequada de Köhler.

Para operar este tutorial, use os controles deslizantes para mudar o foco dos planos conjugados nos raios de luz de iluminação (controle deslizante esquerdo) e/ou nos raios de luz formadores de imagem (controle deslizante direito). Você notará que, à medida que os controles deslizantes são movidos, todas as imagens (o filamento ou o espécime) entram e saem do foco juntas.

A Figura 2 ilustra uma configuração típica do microscópio onde a carcaça da lâmpada (fonte de iluminação) é fixada à base e projeta a luz através de várias lentes e, em seguida, através do condensador de subestágio após ser refletida por um espelho na base do

microscópio. A própria fonte de luz deve ser pré-centrada ou centrada ao eixo óptico do microscópio. A luz emitida pelo filamento da lâmpada de tungstênio-halogênio passa primeiro pela lente do coletor localizada perto da carcaça da lâmpada e, em seguida, por uma segunda lente mais próxima do diafragma do campo. Muitas vezes, um filtro de vidro sinterizado ou fosco é colocado entre a lâmpada e a lente do coletor para difundir a luz e garantir uma intensidade uniforme de iluminação. Na prática, a imagem do filamento da lâmpada é focalizada no plano focal frontal do condensador, enquanto o vidro do difusor é temporariamente removido do caminho da luz. A distância focal da lente do coletor deve ser cuidadosamente combinada com as dimensões do filamento da lâmpada para garantir que uma imagem de filamento do tamanho adequado seja projetada na abertura do condensador. Para uma iluminação adequada da Köhler, a imagem do filamento deve preencher completamente a abertura do condensador.

A segunda lente no caminho da luz é chamada de lente de campo, que é responsável por colocar a imagem do filamento em foco no plano do diafragma de abertura do condensador de subestágio. A luz focalizada que sai da lente de campo é refletida por um espelho (posicionado em um ângulo de 45 graus em relação ao caminho da luz) através do diafragma de campo e no condensador de subestágio. O diafragma de campo serve como uma fonte virtual de luz para o microscópio e sua imagem é focalizada pelo condensador no plano da amostra. Os desenhos ópticos para a disposição desses elementos podem variar de acordo com o fabricante do microscópio, mas o diafragma de campo deve ser posicionado a uma distância suficiente da lente de campo para eliminar poeira e imperfeições da lente de serem fotografadas no plano da amostra.

Vias Ópticas de Microscopia de Luz Transmitida - Java Tutorial

Este tutorial explora as vias ópticas em um microscópio de luz transmitida. Instruções e uma discussão sobre como operar este tutorial aparecem imediatamente abaixo da janela.

Para operar o tutorial, use as barras deslizantes sob o microscópio para controlar a abertura do diafragma de campo (controle deslizante esquerdo), o diafragma de abertura (condensador) (controle deslizante médio) e a intensidade da iluminação (controle deslizante direito). O botão controla se a visão interna ("interna") ou externa ("externa") do microscópio está selecionada.

O diafragma de campo na base do microscópio controla apenas a largura do feixe de raios de luz que atinge o condensador - não afeta a resolução óptica, a abertura numérica ou a intensidade da iluminação. O ajuste adequado do diafragma do campo (isto é, centrado no caminho óptico e aberto de modo a ficar fora do campo de visão) é importante para evitar o ofuscamento que pode reduzir o contraste na imagem observada. A eliminação do excesso de luz é particularmente importante quando se tenta obter imagens de amostras com contraste inerentemente baixo. Quando o diafragma de campo é aberto demais, a luz dispersa proveniente do espécime e a luz refletida em ângulos oblíquos das superfícies ópticas podem atuar para degradar a qualidade da imagem.

O condensador de subestágio é normalmente montado diretamente abaixo do estágio do microscópio em um suporte que pode ser elevado ou abaixado independentemente do estágio girando um botão retorcido, como ilustrado na Figura 2. O diafragma de abertura é aberto e fechado com um braço oscilante, uma alavanca ou girando um colar na carcaça do condensador. Deve-se notar que o ajuste correto do condensador de subestágio é provavelmente o aspecto mais crítico para alcançar a iluminação Köhler adequada. Infelizmente, no entanto, o desalinhamento do condensador e os diafragmas de abertura do condensador ajustados incorretamente são a principal fonte de degradação da imagem e fotomicrografia de baixa qualidade.

Quando devidamente ajustada, a luz do condensador preencherá o plano focal posterior da objetiva com luz formadora de imagem, projetando um cone de luz para iluminar o campo de visão (Uma discussão completa dos condensadores de subestágio está incluída em outra seção do primer). O diafragma de abertura do condensador é responsável por controlar o ângulo do cone de luz iluminante e, consequentemente, a abertura numérica do condensador. Este conceito é ilustrado na Figura 3, onde uma série de condensadores são ilustrados com cones de luz (e aberturas numéricas) de tamanho decrescente da esquerda para a direita na figura. As formas do cone de luz do condensador também são uma função do grau de correção para aberração óptica, como demonstrado no tutorial interativo de Java abaixo:

A Figura 3(a) ilustra um condensador de abertura numérica de aproximadamente 1,20, que possui um amplo cone de luz permitindo a obtenção de imagens do corpo de prova com objetivas de alta abertura numérica. As Figuras 3(b-d) mostram como a redução do tamanho do diafragma de abertura produzirá uma diminuição correspondente no tamanho do cone de luz e na abertura numérica (Figura 3(b) NA = 0,60; Figura 3(c) NA = 0,30; Figura 3(d) NA = 0,15). Também construímos um tutorial interativo em Java que demonstra como o tamanho e a forma do cone de luz do condensador varia com a abertura numérica.

É importante notar, com relação ao tamanho e à forma dos cones de luz do condensador, que a redução do tamanho do diafragma de campo serve apenas para diminuir ligeiramente o tamanho das porções inferiores dos cones de luz ilustrados na Figura 3. O ângulo e a abertura numérica do cone de luz permanecem essencialmente inalterados com a redução do tamanho do diafragma de campo. Outro conceito importante, muitas vezes esquecido pelos novatos, é que a intensidade da iluminação não deve ser controlada através da abertura e fechamento do diafragma da abertura do condensador, nem deslocando o condensador axialmente em relação ao centro óptico do microscópio. A intensidade da iluminação só deve ser controlada através do uso de filtros de densidade neutra colocados no caminho da luz ou reduzindo a tensão para a lâmpada (embora esta última não seja geralmente recomendada, especialmente para fotomicrografia). Para garantir o máximo desempenho da lâmpada de tungstênio-halogênio, consulte o manual de instrumentos do fabricante para determinar a tensão ideal da lâmpada (geralmente 6-10 volts) e use essa configuração. O brilho da iluminação pode então ser facilmente controlado adicionando ou removendo filtros de densidade neutra.

O tamanho do diafragma da abertura do condensador de subestágio não deve apenas coincidir com a abertura numérica desejada, mas também a qualidade da imagem resultante deve ser considerada. Geralmente, o diafragma de abertura deve ser ajustado para fornecer contraste de imagem suficiente sem ser fechado a ponto de introduzir uma perda de resolução e detalhes. O índice de refração e o contraste inerente do espécime são muito importantes na determinação do tamanho do diafragma da abertura. Em geral, o diafragma deve ser ajustado para uma posição que permita 60 a 90 por cento de todo o tamanho do disco de luz (visível no tubo ocular após a remoção da ocular ou com uma lente Bertrand), embora isso possa variar com extremos no contraste da amostra.

Os efeitos do ajuste da abertura do condensador sobre a qualidade das imagens captadas pela fotomicrografia estão ilustrados na Figura 4. O espécime é uma fina seção da haste de Tilia (Basswood) corada com Fast Green e Eosin e fotografada em filme transparente Fujichrome 64T usando uma objetiva Planachromat 40x (NA = 0,75) e um condensador acromático de lente superior oscilante (NA = 0,90). As configurações aproximadas de abertura da abertura do condensador são: Figura 4(a) - 90 por cento (NA = 0,81); Figura 4(b) - 60% (NA = 0,54); Figura 4(c) - 20 por cento (NA = 0,18). O corte do tecido é seletivamente corado para revelar detalhes finos e diferenciar componentes subcelulares para observação.

Na Figura 4(a), onde o diafragma de abertura é ajustado para uma posição em que a abertura numérica do condensador e da objetiva são quase iguais, grande parte do detalhe fino do corpo de prova é visível, embora permaneça uma quantidade considerável de espalhamento e ofuscamento. A imagem também é significativamente mais brilhante do que suas contrapartes, que foram feitas com uma configuração menor do diafragma de abertura. A Figura 4(b) ilustra a haste de Tilia em um tamanho de abertura do condensador que produz uma abertura numérica de aproximadamente 70% da objetiva. O brilho é reduzido, a imagem é muito nítida e detalhes finos da imagem estão presentes sem artefatos de difração significativos. Para este espécime, a fotomicrografia da Figura 4(b) representa o ajuste ideal para o diafragma da abertura do condensador. Quando o diafragma é fechado para a menor configuração em cerca de 25 por cento da abertura numérica objetiva (Figura 4(c)), detalhes finos da imagem ficam obscurecidos com artefatos de difração e fenômenos de refração. A imagem também assume um molde geral mais escuro que produz mudanças nos tons de cor do espécime. Este conceito pode ser explorado em maiores detalhes usando o tutorial interativo Java no diafragma de abertura do condensador de subestágio.

A partir da discussão acima, fica evidente que o diafragma da abertura do condensador deve ser ajustado para uma posição que forneça uma mistura comprometedora de luz direta e desviada que dependa, em grande parte, das características de absorção, difração e refração do corpo de prova. Isso deve ser feito sem sobrecarregar a imagem com artefatos que obscurecem detalhes e apresentam realce errôneo de contraste. A quantidade de detalhes e contraste da imagem necessária para produzir a melhor fotomicrografia também depende do índice de refração, das características ópticas e de outros parâmetros dependentes do espécime.

Quando o diafragma da abertura é erroneamente fechado muito longe, a luz desviada começa a obscurecer os raios iluminados diretos, resultando em artefatos de difração que causam franjas visíveis, bandas e/ou formação de padrões em fotomicrografias. Outros problemas, como fenômenos de refração, também podem produzir estruturas aparentes em uma imagem que não são reais. Alternativamente, abrir a abertura do condensador muito larga causa ofuscamento indesejado e dispersão de luz da amostra e superfícies ópticas dentro do microscópio. Isso leva a uma perda significativa de contraste e lavagem de detalhes da imagem. A configuração correta varia de espécime para espécime, e o microscopista experiente logo aprenderá a ajustar com precisão o diafragma da abertura do condensador (e a abertura numérica do sistema) observando a imagem sem ter que visualizar o diafragma no plano focal posterior da objetiva. De fato, muitos microscopistas acreditam que a redução crítica da abertura numérica do sistema de microscópio para otimizar a qualidade da imagem é o passo mais importante na fotomicrografia.

O sistema de iluminação do microscópio, quando ajustado para a iluminação adequada da Köhler, deve satisfazer vários requisitos. A área iluminada do plano do espécime deve ser pelo menos tão grande como o campo de visão para um determinado objectivo. Além disso, a luz deve ser de intensidade uniforme e a abertura numérica deve variar de um valor máximo (igual ao da objetiva) a um valor mínimo que dependerá das características ópticas do provete. A Tabela 1 contém uma lista de aberturas numéricas objetivas versus o diâmetro do campo de visão (para uma ocular de campo número 18) para cada objetiva, variando de ampliações muito baixas a muito altas.

Designação Objetiva	Abertura Numérica	Diâmetro do campo de visão
Plancromata 1x	0.04	18.0
Plancromata 2x	0.06	9.0
Plancromata 4x	0.10	4.50
Plancromata 5x	0.15	3.60
Plancromata 10x	0.25	1.80
Plancromata 20x	0.40	0.90
Plancromata 40x	0.65	0.45
Planapocromata 50x	0.90	0.36
Planapocromata 60x	0.95	0.30
Planapocromata 100x	1.40	0.18

Tabela 1

Pelos dados apresentados na Tabela 1, é óbvio que a variação dos diâmetros de campo de visão é de 100 vezes, passando do 1x Planapocromato para o 100x Planapocromato. Isso gera uma incrível diferença de 10.000 vezes na área de iluminação entre as objetivas de 1x e 100x. Uma gama tão ampla de áreas de iluminação requer ajustes em muitos componentes no caminho óptico para acomodar todas as ampliações. Estes cálculos foram feitos assumindo um número de campo de ocular de 18, mas muitos microscópios modernos são equipados com oculares de campo largo com números de campo de 20 ou 25. O diâmetro do campo de visão (conforme indicado na coluna três da Tabela 1) pode ser recalculado para qualquer ocular usando a seguinte fórmula:

D = (FN) / M

onde D é o diâmetro do campo de visão, FN é o número do campo da ocular e M é a ampliação objetiva.

Os microscópios modernos são equipados com condensadores de subestágio especializados que possuem uma lente oscilante, que pode ser removida do caminho óptico para uso com objetivas de menor potência (2x a 5x). Isso altera o desempenho dos componentes restantes no caminho da luz, e alguns ajustes são necessários para alcançar as melhores condições de iluminação. O diafragma de campo não pode mais ser usado para alinhamento e centralização do condensador de subestágio e agora é ineficaz em limitar a área do corpo de prova sob iluminação. Além disso, grande parte do brilho indesejado uma vez removido pelo diafragma de campo é reduzido porque a lente superior do condensador produz um cone de luz com uma abertura numérica muito menor, permitindo que os raios de luz passem através do espécime em ângulos muito mais baixos. Mais importante ainda, as condições ópticas para a iluminação Köhler não se aplicam mais.

O alinhamento dos componentes ópticos do microscópio e o estabelecimento das condições de iluminação Köhler devem ser sempre realizados em uma ampliação maior (10x) antes de remover a lente condensadora oscilante para trabalhar em ampliações mais baixas (5x e abaixo). A altura do condensador não deve ser alterada. O desempenho do condensador é radicalmente alterado quando a lente oscilante é removida. A imagem do filamento da lâmpada não é mais formada no diafragma de abertura, que deixa de controlar a abertura numérica do condensador e do sistema de iluminação. Na verdade, o diafragma de abertura deve ser aberto completamente para evitar vinhetas, um desvanecimento gradual da luz nas bordas do campo de visão.

A via óptica modificada para a transmissão de luz em um sistema de microscópio de baixa potência é ilustrada na Figura 5. O diafragma de campo está agora posicionado no plano correto para atuar como uma parada de abertura para controlar a abertura numérica e o tamanho e a forma do cone de luz para os raios de luz iluminados e formadores de imagem que passam pelo condensador. O plano do espécime é totalmente iluminado com cones equiangulares (como na iluminação de Köhler), no entanto, o filamento é agora fotografado na montagem da lente traseira da objetiva em vez do plano focal traseiro.

É importante notar que a imagem do diafragma de campo não é mais formada no

plano do espécime, embora a intensidade geral da iluminação ainda seja uniforme dentro do campo de visão, desde que a lente do condensador da lâmpada seja ligeiramente difusa (gravada quimicamente) ou fosca. As novas funções do diafragma de campo em microscopia de baixa magnificação são o tema de um tutorial interativo em Java sobre ajuste de contraste de espécimes em baixas ampliações.

É importante notar que a imagem do diafragma de campo não é mais formada no plano do espécime, embora a intensidade geral da iluminação ainda seja uniforme dentro do campo de visão, desde que a lente do condensador da lâmpada seja ligeiramente difusa (gravada quimicamente) ou fosca. As novas funções do diafragma de campo em microscopia de baixa magnificação são o tema de um tutorial interativo em Java sobre ajuste de contraste de espécimes em baixas ampliações.

O ajuste do contraste na microscopia de baixa magnificação é semelhante ao procedimento que utiliza objetivas de alta magnificação, como ilustrado na Figura 4. Quando o diafragma do campo está aberto (maior que 80 por cento), os detalhes do espécime são lavados e uma quantidade significativa de espalhamento e brilho está presente. Fechar o diafragma de campo para uma posição entre 50 e 80 por cento produzirá o melhor compromisso no contraste e profundidade de campo da amostra. Os objetivos projetados para baixa ampliação são significativamente mais simples no design do que seus equivalentes de ampliação mais alta. Isso se deve aos menores ângulos de iluminação dos cones de luz produzidos pelos condensadores de baixa ampliação, que exigem objetivos de menor abertura numérica.

Os retículos de medição, que devem estar em foco nítido e sobrepostos à imagem do espécime, podem ser inseridos em vários dos planos conjugados discutidos acima. A medida ocular (ocular) mais comum e os retículos fotomicrográficos são colocados no plano intermediário da imagem, que é um diafragma de abertura fixa dentro da ocular. Teoricamente, também é possível colocar retículos no plano do espécime ou no plano do diafragma do campo iluminado. Os micrômetros de estágio são "retículos" especializados colocados em microlâminas, que são usados para calibrar retículos de oculares e fazer medições de amostras. A colocação de retículos no plano do diafragma de campo nunca é feita (até onde sabemos) e exigiria um condensador de correção muito alta para aberração para eliminar completamente os artefatos e fornecer uma imagem nítida para medição.

Ambos os filtros de cor e densidade neutra são frequentemente colocados dentro do caminho óptico para reduzir a intensidade da luz e alterar as características de cor da iluminação. Existem vários locais dentro do suporte do microscópio onde esses filtros são geralmente colocados. Alguns microscópios de laboratório modernos têm um suporte de filtro prensado entre a carcaça da lâmpada e a lente do coletor, que serve como um local ideal para esses filtros. Muitas vezes, filtros de densidade neutra, juntamente com filtros de correção de cor e um filtro de difusão fosco são colocados juntos neste suporte de filtro. Outros projetos de microscópio fornecem um conjunto de filtros embutidos internamente no corpo que podem ser alternados no caminho da luz por meio de uma alavanca. Um terceiro local comum para filtros é um suporte montado na parte inferior do condensador de subestágio, significativamente mais baixo do que o diafragma de abertura, que aceitará filtros de gelatina ou vidro.

É importante não colocar filtros dentro ou perto de qualquer um dos planos conjugados formadores de imagem para evitar sujeira ou imperfeições superficiais nos filtros a serem fotografados junto com a amostra. Alguns microscópios têm um acessório para colocar filtros perto da porta de luz na base (perto do diafragma do campo). Esse posicionamento é provavelmente muito próximo do diafragma de campo, e a contaminação da superfície pode estar em foco nítido ou aparecer como artefatos borrados sobrepostos à imagem. Também não é aconselhável colocar filtros diretamente no estágio do microscópio pelas mesmas razões.

Para uma leitura mais aprofundada, convidamos os visitantes a examinar nossa Bibliografia, onde inúmeras citações se referem a excelentes livros que tratam de vários tópicos em iluminação de microscópios e a técnica de Köhler. Também descrevemos como ajustar microscópios transmitidos e refletidos para iluminação Köhler.

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