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Iluminação Köhler com Luz Refletida

Na microscopia de luz refletida de campo claro, o uso adequado

uso adequado dos dois diafragmas variáveis ilustrados na Figura 1 — Figura 1

dos dois diafragmas variáveis ilustrados na Figura 1, o diafragma de abertura da íris (mais próximo da fonte de luz) e o diafragma da íris de campo (mais próximo do espécime), permitem o uso da altamente desejável iluminação Köhler.

Esses diafragmas estão no oposto de suas respectivas posições na luz transmitida, sendo o diafragma de abertura agora mais próximo da fonte de luz. Tal iluminação fornece luz brilhante uniformemente dispersa pelo plano do campo de visão do espécime focalizado. A iluminação Köhler fornece luz sem brilho utilizando a participação máxima da abertura numérica da objetiva consistente com bom contraste e resolução.

É importante notar que, nesses sistemas de luz refletida, o objetivo tem uma dupla função: na descida como um condensador bem corrigido devidamente alinhado; no caminho para cima como um objetivo formador de imagem no papel habitual de um objetivo projetando os raios portadores de imagem em direção à ocular. Em um sistema de luz transmitida, a mudança da objetiva requer um ajuste na abertura numérica do condensador para corresponder à da nova objetiva. No entanto, na luz refletida, as aberturas numéricas da objetiva e do condensador mudam simultaneamente com uma nova objetiva. Os planos conjugados são semelhantes aos descritos para a luz transmitida, com imagens da fonte de luz sendo formadas no plano focal posterior da objetiva e dentro da abertura da íris do diafragma da abertura. Isso serve para reduzir a complexidade de estabelecer as condições de iluminação de Köhler na microscopia de luz refletida.

Uma função da iluminação Köhler (além de fornecer iluminação uniformemente dispersa) é garantir que o objetivo seja capaz de entregar excelente resolução e bom contraste, mesmo que a fonte de luz seja uma lâmpada de filamento de bobina. O diafragma da íris de abertura controla o ângulo de luz que atinge o espécime de cada azimute em um cone completo em luz refletida de campo brilhante. A abertura numérica da objetiva determina o ângulo de luz que pode ser "capturado" à medida que é refletido a partir do espécime. Outros fatores sendo iguais, quanto maior a abertura numérica, melhor a resolução do objetivo, ou seja, melhor o objetivo é capaz de separar claramente pequenos detalhes que estão próximos. O iluminador vertical do sistema contém o diafragma da íris de abertura para que a parte de trás do próprio objetivo não precise ser ocluída.

Na iluminação Köhler, o sistema é organizado (Figura 2) de modo que a imagem do filamento da bobina da lâmpada seja colocada em foco no plano do diafragm

a da íris de abertura; também está em foco no plano focal posterior do objetivo. Supondo que não haja filtro fosco no caminho da luz do iluminador, quando uma ocular é removida, a imagem do filamento da lâmpada pode ser vista na parte de trás da objetiva. Na maioria dos sistemas, o exterior da carcaça da lâmpada possui um conjunto de parafusos de centralização (Figura 3), que permitem centralizar o filamento da lâmpada movendo o filamento na direção norte-sul ou leste-oeste. Além disso, o fechamento ou abertura do diafragma da abertura da íris é observável no plano focal posterior da objetiva, como descrito acima.

O diafragma da íris de campo é conjugado (pré-focado) com o espécime focalizado, o plano intermediário da imagem no plano do diafragma fixo da ocular e a retina do olho.

A microscopia de luz refletida é de crescente interesse, especialmente no que diz respeito à sua crescente utilidade na microscopia de fluorescência. O rápido crescimento da indústria de semicondutores também levou a um aumento no uso de microscópios de luz refletida, que continuam a ser muito úteis em aplicações clássicas, como metalografia, petrografia de minério e pesquisa de materiais.

exterior da carcaça da lâmpada possui um conjunto de parafusos de centralização (Figura 3) — Figura 3

Na prática, o espécime é primeiramente focalizado com uma objetiva de aumento médio, geralmente de 10x, e a abertura do diafragma de campo pré-focalizado é fechada até que seja visível na periferia do campo de visão. Se o diafragma da íris do campo não estiver centralizado, os parafusos de centralização no iluminador vertical são usados para mover uma abertura de íris parcialmente fechada para o centro do campo. O diafragma é então aberto até desaparecer da vista ou da área delineada pelo quadro do filme em um retículo fotomicrográfico. Em seguida, o filamento da lâmpada é centralizado e focalizado (se isso não tiver sido feito na fábrica), e o diafragma de abertura é ajustado para o contraste e a qualidade de imagem ideais da amostra. Essas etapas são discutidas em detalhes nas seções abaixo.

Ajuste do Microscópio de Luz Refletida para Iluminação Köhler

Oculares e Diafragma de Campo

Escolha uma amostra que tenha um alto grau de refletividade para maximizar a quantidade de luz refletida de volta para a objetiva durante as etapas iniciais de configuração da iluminação Köhler. Uma escolha ideal é um circuito integrado em silício altamente reflexivo, uma seção de metal altamente polido ou uma película fina metálica lisa. O espécime deve possuir algum grau de detalhe ou textura que possa ser usado para encontrar o plano focal do espécime.
Coloque o espécime reflexivo no palco e ative a fonte de luz, que geralmente é uma lâmpada de tungstênio-halogênio posicionada em uma caixa de lâmpada semelhante à ilustrada na Figura 3. Gire o nariz para posicionar uma objetiva de média potência, como a de 10x, voltada para o espécime. Se a lâmpada estiver funcionando corretamente, um pequeno círculo de luz de cerca de 3 milímetros de diâmetro deve ser projetado pela objetiva na superfície do espécime.
Enquanto observa a objetiva e o espécime, use o botão de foco grosso para elevar o palco até que ele fique alguns milímetros abaixo da lente frontal da objetiva. Tenha muito cuidado para não conduzir o espécime para a lente frontal objetiva. Em seguida, enquanto observa o espécime através das oculares, abaixe lentamente o estágio com (no início) o botão de foco grosso e, em seguida, o botão de foco fino até que os detalhes do espécime entrem em foco nítido. Se o ponto de foco for perdido, comece de novo com uma distância um pouco menor entre a lente frontal objetiva e o espécime. Em muitos casos, é mais fácil encontrar o foco correto se o espécime estiver se movendo ao tentar estabelecer o foco. Faça isso girando um estágio circular de 360 graus ou usando os botões do estágio mecânico para traduzir o espécime para frente e para trás no campo de visão.
Ajuste o distância interpupilar em microscópios binoculares, uma vez que o espécime está em foco nítido. Ajustes dióptricos em cada uma das oculares também deve ser feito neste momento.
Muitos microscópios de contraste polarizador e de interferência diferencial (DIC) são equipados com estágios graduados circulares que giram 360 graus em torno do eixo óptico do microscópio. Estes microscópios são geralmente equipados com ajustes individuais (através de parafusos fixos na peça nasal) para cada objetiva para permitir que o eixo óptico da objetiva seja feito concêntrico com o eixo óptico do microscópio. É uma boa ideia fazer esse ajuste antes de prosseguir.

O próximo passo é ajustar o diafragma de campo, que é o diafragma da íris mais próximo da frente do microscópio, conforme ilustrado na Figura 4. — Figura 4

O próximo passo é ajustar o diafragma de campo, que é o diafragma da íris mais próximo da frente do microscópio, conforme ilustrado na Figura 4. Às vezes, o diafragma é rotulado como "F" ou "Campo" diretamente na carcaça do iluminador. Use o ajuste da alavanca para fechar o diafragma da íris do campo até começar a ver as folhas no campo de visão. Continue a fechar o diafragma até o ponto em que a alavanca pare e apenas uma pequena abertura seja visível nas oculares. O espécime e as folhas do diafragma devem estar ambos em foco nítido, uma configuração que geralmente é feita na fábrica porque a maioria dos microscópios modernos de luz refletida não estão equipados para permitir o ajuste da posição axial do diafragma de campo (ele não pode ser focalizado). Isso ocorre porque o objetivo cumpre um duplo papel de também ser o condensador, de modo que planos focais críticos são predefinidos na fábrica para minimizar os erros de alinhamento do microscópio. Na maioria dos casos, haverá pequenas diferenças entre o foco e o centro do diafragma de campo nos vários objetivos, mas essa pequena flutuação geralmente pode ser negligenciada.
Um conjunto de botões de centralização é posicionado na carcaça externa do iluminador vertical perto do diafragma de campo que permite ao usuário centralizar o diafragma de campo no campo de visão. Use esses botões para centralizar a imagem do diafragma de campo e, em seguida, abra lentamente as folhas da íris até que a imagem do diafragma esteja fora do campo de visão. Se a fotomicrografia for a principal consideração, o diafragma de campo deve ser aberto apenas com largura suficiente para permitir que a área delineada no quadro do filme (inscrita em um retículo fotomicrográfico) seja visível. A mudança de objetivos não exigirá ajuste da configuração do tamanho do diafragma de campo, pois o novo objetivo também atuará como condensador e a relação permanecerá a mesma. Isso é facilmente verificado fechando-se o diafragma de campo a um tamanho pré-determinado em relação à fotomicrografia ou retículo de medição. Depois de alterar o objetivo, o tamanho da imagem no campo de visualização mudará, mas a relação de tamanho entre o diafragma do campo e o retículo não.

Alinhamento do filamento e ajuste da abertura

Assim como na iluminação Köhler na luz transmitida, o ajuste do diafragma de abertura ("condensador") na luz refletida é fundamental para controlar o contraste da amostra, reduzir artefatos de difração e ofuscamento e produzir a melhor qualidade de imagem. A imagem do filamento deve estar em foco e preencher completamente o diafragma de abertura, semelhante à situação com a luz transmitida.
O primeiro passo é centralizar e focar o filamento da lâmpada. Alguns microscópios modernos de luz refletida (especialmente modelos de pesquisa de ponta) são equipados com uma lâmpada pré-centrada de tungstênio-halogênio em uma caixa que também é equipada com uma lente coletora e uma tela difusora. Não há ajustes nesses sistemas, mas muitos sistemas de epi-iluminação mais antigos possuem lâmpadas que devem ser centralizadas, e mecanismos de ajuste são fornecidos para esse fim. O primeiro passo é remover (se possível) o filtro de difusão de vidro que espalha a iluminação uniformemente sobre o campo de visão. Em seguida, use os botões de ajuste (ver Figura 3) para centralizar o filamento enquanto observa a imagem conjugada no plano focal traseiro objetivo. Isso é feito de maneira semelhante à dos microscópios de luz transmitida, onde a ocular é removida e a abertura do condensador e a imagem do filamento são visualizadas no plano focal posterior da objetiva através do tubo ocular. Visitantes e estudantes são convidados a explorar o alinhamento de filamentos no seguinte tutorial interativo de Java:

Quando a ocular é removida do tubo ocular, uma imagem do filamento da lâmpada (em foco nítido) deve ser visível no plano focal posterior da objetiva, juntamente com um diafragma de abertura parcialmente fechado. Esta observação é facilitada pelo uso de um telescópio de fase, uma lente Bertrand (um acessório geralmente encontrado em microscópios de luz polarizada) ou através de uma tampa final com um orifício de pino no centro. Este último pode ser feito a partir de um plugue ocular que é usado para proteger o interior do microscópio durante o envio. Se a tela do difusor de vidro fosco não tiver sido (ou não puder ser) removida, um disco de luz uniformemente iluminado deve aparecer no lugar das bobinas de filamento. Se o filamento não estiver centralizado, aparecerão "pontos quentes" no disco de luz, que podem ser sanados ajustando-se os parafusos no abajur (Figura 3). Continue fazendo ajustes incrementais até que a iluminação seja uniforme em todo o disco de luz.
O último passo é ajustar a abertura do diafragma de abertura, que geralmente é identificado pela letra "A" ou pela palavra "Abertura" no exterior do iluminador vertical. Em um microscópio de luz transmitida, o diafragma da abertura do condensador deve ser reajustado cada vez que uma nova objetiva de abertura numérica diferente é inserida no caminho da luz. Isso se deve ao fato de que o objetivo e o condensador são entidades separadas e a alteração da abertura numérica objetiva não afeta o condensador. Para compensar, o diafragma da abertura do condensador deve ser aberto ou fechado para fornecer um cone de luz iluminador que corresponda à abertura numérica da objetiva. No entanto, na microscopia de luz refletida, a objetiva também atua como condensadora (como discutido acima, fornecendo vias de luz iluminantes e formadoras de imagens), e as aberturas numéricas mudam de acordo quando uma nova objetiva é selecionada.

Determinar o ajuste correto do diafragma de abertura é fundamental para obter imagens livres de artefatos de difração, que possuam contraste suficiente e sejam da mais alta qualidade. Muitas vezes, isso resulta de um trade-off em que um compromisso é alcançado entre maximizar o contraste da imagem sem introduzir artefatos errôneos devido à refração e difração. Como mencionado acima, o diafragma de abertura deve ser redefinido a cada mudança objetiva na microscopia de luz transmitida. No entanto, na microscopia de luz refletida, a objetiva e o "condensador" mudam com incrementos simultâneos na abertura numérica e um único ajuste pode ser escolhido para o diafragma de abertura. Esta configuração é tipicamente entre 60 e 95 por cento aberta, mas irá variar de espécime para espécime e dependerá fortemente da refletividade do espécime. Espécimes altamente reflexivos exigirão uma abertura menor para reduzir o brilho e melhorar o contraste, mas isso é melhor realizado caso a caso. O melhor procedimento é primeiro abrir a abertura para sua configuração mais larga e, em seguida, fechá-la lentamente enquanto visualiza a amostra para otimizar o contraste. Na fotomicrografia, muitas vezes é sábio "colher" um conjunto de micrografias, cada uma com um tamanho de abertura ligeiramente diferente.

As técnicas descritas acima para microscopia de luz refletida de campo claro também se aplicam a microscópios equipados para polarização cruzada, fluorescência e contraste de interferência diferencial (CIVD). Na verdade, o microscópio pode ser ajustado para a iluminação de Köhler enquanto em qualquer um desses modos, e muitas vezes os aprimoramentos de contraste podem ser trocados sem a necessidade de realinhar a iluminação do microscópio.

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